李雨阳, 文湘华, 丁鵾, 张冰, 申博. 污水处理系统中氨氧化古菌的富集培养以及性质[J]. 微生物学报,): 882-891.
Yuyang Li, Xianghua Wen, Kun Ding, Bing Zhang, Bo Shen. 2015. Cultivation and characterization of an ammonia oxidizing archaeon enriched from wastewater treatment plant[J]. Acta Microbiologica Sinica, ): 882-891.
污水处理系统中氨氧化古菌的富集培养以及性质
李雨阳, 文湘华
, 丁鵾, 张冰, 申博&&&&
清华大学环境学院, 北京 100084
资助课题：国家自然科学基金()
作者简介: 李雨阳(1990-),男,云南省人,硕士研究生,研究方向环境微生物学。E-mail:
通讯作者: 文湘华,Tel: +86-10-; E-mail:
摘要：[目的] 从污水处理系统中富集培养氨氧化古菌,鉴定其系统发育地位,进行初步的形态观察以及生长和代谢特性研究。[方法] 使用添加抗生素的自养培养基,通过连续传代的方法富集培养氨氧化古菌,使用多种分子生物学方法检验富集纯度和古菌单一性,鉴定其系统发育地位;通过扫描电镜观察菌体基本形态;利用生长和代谢曲线计算相关性质参数。[结果] 氨氧化古菌HJ-2b富集培养成功,在体系中的纯度达到93%;经16S rRNA基因鉴定属于亚硝化球菌(Nitrososphaera)属,与Nitrososphaera sp. JG1相似度为100%,但功能基因amoA的相似度仅为72%;HJ-2b细胞呈杆状,其最大比增长速率为0.43 d-1,最大比氨氧化速率为3.9 fmol/(cell·d)。[结论] HJ-2b富集物来源于污水处理系统,对于研究氨氧化古菌在该系统中的存在条件及其在污水脱氮方面的贡献有重要意义。
污水处理系统&&&&氨氧化古菌&&&&富集培养&&&&比增长速率&&&&比氨氧化速率&&&&
Cultivation and characterization of an ammonia oxidizing archaeon enriched from wastewater treatment plant
Yuyang Li, Xianghua Wen , Kun Ding, Bing Zhang, Bo Shen&&&&
School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China
Abstract:[Objectives] To enrich ammonia-oxidizing archaeon (AOA) from wastewater treatment plants, identify its phylogenetic status, morphology and determine its growth and ammonia oxidation rates. [Methods] AOA was enriched in autotrophic medium containing antibiotics by using consecutive passage. The purity, uniformity and phylogenetic status of archaeal enrichment were determined with different molecular tools. The morphology was determined with scanning electron microscopy. The AOA growth andammonia oxidation rates were calculated from the corresponding experimental results. [Results] An AOA enrichment HJ-2b with purity of 93% was obtained.The similarity of its 16S rRNA gene with Nitrososphaera sp. JG1 was 100%, suggesting it belonged to Nitrososphaera spp., although the similarity of amoA gene between these two species was only 72%. HJ-2b cell was rod-shaped, with the maximum specific growth rate of 0.43 d-1, the specific ammonia-oxidation rate of 3.9 fmol/(cell·d). [Conclusions] HJ-2b has great significance in studying the occurrence and contribution of AOA in wastewater treatment.
Key words:
wastewater treatment plant&&&&ammonia-oxidizing archaea&&&&enrichment&&&&specific growth rate&&&&specific ammonia oxidation rate&&&&
硝化反应在氮循环中起着重要作用，同时也是污水处理系统脱氮的关键反应。氨氧化反应是硝化反应的第一步，也是其中的限速步骤。一直以来该步骤都被认为是由氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria，AOB)独自参与的。然而近年来研究发现，参与氨氧化反应的微生物还有另外一个大的类群，即氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea，AOA)[, ]。AOA属于古菌中的奇古菌门(Thaumarchaeota)[]，与AOB在进化归属，生理生化特性方面存在较大差异，但二者参与氨氧化过程的部分基因是同源的。其中应用最多的是编码氨单加氧酶α亚基的amoA基因，以该基因作为指示，发现AOA广泛分布于海洋[]、土壤[]、热泉以及污水处理系统[]等环境中，是氨氧化过程的重要参与者。与AOB相比较，AOA对于底物氨氮和氧具有较高的亲和力[]，这使得AOA在低氨氮和低溶解氧条件下依然能够有较好的氨氮去除效果。
当前国内外的研究主要以调研和统计AOA的分布情况为主，对AOA进行富集和分离的研究仍然较少。由于古菌本身生长缓慢，受环境波动影响大，富集和分离较为困难。目前已报道的纯培养AOA只有两株：海洋亚硝化短小杆菌(Nitrosopumilus maritimus[])和维也纳亚硝化球菌(Nitrososphaera viennensis[])，此外富集培养的AOA有8株。这些菌株都是从海洋沉积物[, , ]、土壤[, , , , ]、热泉[, ]等自然环境中富集得到的，到目前为止，还没有从污水处理系统(活性污泥)中富集分离AOA的报道。
污水处理系统依靠氨氧化反应来去除氨氮，研究者在国内外多个污水处理系统中均发现了AOA[, , , ]，在部分系统中，AOA的数量甚至超过AOB几个数量级[, , ]。但与AOB不同的是，并非每一个氨氮去除效果良好的系统中都能发现AOA的存在。研究者对于影响AOA存在性的因素做出了多种不同的猜测，包括氨氮浓度[]、溶解氧[, ]、盐度[]、停留时间[]等。由于缺乏来源于污水处理系统的富集菌株，上述猜测无法通过直接的微生物学实验证实，仅停留在调研和统计阶段。
本研究针对上述存在的问题，从污水处理系统中富集得到高纯度的AOA，经过系统发育鉴定之后，确认其中仅含有一种AOA，之后对其生长特性和代谢特性进行了研究。本研究对深入了解污水处理系统中AOA的独特性质，探究AOA在污水处理系统中的存在条件具有重要参考价值。
材料和方法
1.1.1 &&&&富集来源：活性污泥取自天津市某污水处理厂HJ，该厂采用BDP生物倍增工艺，进水氨氮80-300 mg/L，出水氨氮小于1 mg/L，污泥浓度 mg/L。取样点溶解氧浓度为0.6 mg/L。取样后将污泥置于冰盒中暂时保存，带回实验室后立即开始接种培养。1.1.2 &&&&富集培养基：采用的液体培养基包含NH4Cl(0.5 mmol/L)，KH2PO4(0.1 mmol/L),NaHCO3(2.5 mmol/L)，1%污泥上清液(原始污泥离心后取上清，过0.2 μm滤膜(GTTP，millipore)除菌，提供必须的微量元素和维生素等物质)。用1 mol/L的HCl调pH至6.5，121℃灭菌20 min。之后加入氨苄青霉素(50 mg/L)以及链霉素(25 mg/L)。后续的生长和代谢试验采用的培养基与富集一致。1.1.3 &&&&主要试剂和仪器：主要化学制剂均购自国药集团化学试剂有限公司。PCR等分子生物学相关试剂均购自TaKaRa公司。仪器包括PCR仪(S1000，伯乐)，定量PCR仪(iQ5 Multicolor，伯乐)，变性梯度凝胶电泳系统(Decode DGGE，伯乐)，凝胶成像仪(Gel Doc XR，伯乐),紫外分光光度计(DR5000，哈希),环境扫描电子显微镜(Quanta 200，FEI)
AOA的富集培养
用120 mL血清瓶作为培养装置，采用连续传代(consecutive passage)[]的方法进行AOA富集。具体步骤是：初始接种时在50 mL培养基中加入5 mL活性污泥，用橡胶塞密封之后于30℃培养箱避光静置培养。此后每周抽取一定量的培养基进行氨氮和亚硝态氮浓度的检测，氨氮的测量采用水杨酸-次氯酸钠分光光度法，亚硝态氮采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法。在确认80%的氨氮得到降解之后，将5 mL菌液转移到新的50 mL培养基内，进行下一个周期的培养。培养后的细胞用0.2 μm滤膜过滤收集之后用于进一步的分析。
16S rRNA基因和amoA基因的检测及系统发育分析 1.3.1&&&& 16S rRNA基因和amoA基因的检测：DNA的提取采用FastDNA SPIN Kit For Soil试剂盒(MP Biomedicals)，DNA浓度和纯度采用Nanodrop分光光度计(Thermo Nanodrop)分析。PCR试验采用的引物一共有5对，如表 1所示。其中细菌amoA基因采用的扩增程序：94℃ 2 min；94℃ 40 s，51℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次；72℃ 5 min。除此之外其余基因扩增程序均为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次；72℃ 10 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.3.2&&&& 16S rRNA基因和amoA基因测序：扩增后的产物采用Gel extraction Kit试剂盒(Qiagen)进行切胶纯化，一部分用于直接测序，测序采用相应的PCR引物双向进行，由北京诺赛基因公司完成。另一部分用于克隆文库测序，首先将PCR回收产物连接到pGEM-Teasy载体上，再转化到JM109感受态细胞(Promega公司)中。平板培养之后挑取阳性克隆摇菌，PCR鉴定合格之后送出测序。测序采用通用的T7和SP6引物双向进行。1.3.3 &&&&16S rRNA基因和amoA基因系统发育分析：测序得到的双向序列采用DNA star进行拼接，使用NCBI的
BLAST数据库进行序列比对并下载相关序列。使用MEGA 5.2中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树。
16S rRNA基因和amoA基因的定量
16S rRNA基因和amoA基因采用实时荧光定量PCR进行定量。采用的引物有3对，如表 1所示。古菌16S rRNA基因和细菌16S rRNA基因的扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；72℃ 30 s。古菌amoA基因程序与此类似，只是退火温度改为55℃。在制作溶解曲线时，程序均为95℃ 30 s，55℃-95℃升温0.05℃/s。标准曲线采用的模板为相应的目的基因与pGEM-Teasy载体连接制作而成的单克隆质粒。质粒的制作主要包含转化，克隆文库筛选，测序确认等步骤，最后使用Plasmid mini kit试剂盒(Qiagen)提取获得。质粒拷贝数通过测定DNA浓度换算得到。
表 1. 本研究所使用的引物
Table 1. The primers used in this study
Sequence(5′→3′)
Target gene
Application
*GC clamp：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG.
All the primers were from reference 12,except those specially marked.
20FTTCCGGTTGATCCYGCCRG
Archaeal 16S rRNADetection and phylogeny
1492RGGYTACCTTGTTACGACTT
519FCAGCMGCCGCGGTAA
Archaeal 16S rRNAqPCR
727RGCTTTCRTCCCTCACCGT
344F[]GC*-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA
Archaeal 16S rRNADGGE
915R[]GTGCTCCCCCGCCAATTCCT
ATGGTCTGGCTWAGACG
Archaeal amoA
Detection,phylogeny and qPCR
GCCATCCATCTGTATGTCCA
STAATGGTCTGGCTTAGACG
Archaeal amoA
ACATACAGATCGATGGCCGC
27FAGAGTTTGATCMTGGCTCAG
Bacterial 16S rRNA
1492RGGYTACCTTGTTACGACTT
bac518FCCAGCAGCCGCGGTAAT
Bacterial 16S rRNA
bac786RCTACCAGGGTATCTAATC
amoA1FGGGGTTTCTACTGGTGGT
Bacterial amoADetection
amoA2RCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
古菌16S rRNA基因变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析
用于DGGE的古菌16S rRNA基因引物如表 1所示。扩增程序为95℃ 30 s；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃
30 s，循环30次；72℃ 10 min。DGGE采用8%聚丙烯酰胺，40%到60%的变性梯度(100%变性为
7 mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)。采用1×TAE缓冲液，60 V，60℃，电泳17 h。取出后使用Gelred核酸染料(Biotium公司)染色30 min之后拍照。目的条带被切下之后溶解于50 μL无菌水中，采用不含GC夹的DGGE引物扩增之后送出测序。
扫描电镜分析
取5 mL培养后期的菌液，过0.2 μm的GTTP膜截留细胞。将膜取出并置于2.5%的戊二醛溶液中，在4℃条件下静置过夜。用1×PBS缓冲液清洗3次，依次在50%、70%、80%、95%和100%的乙醇溶液脱水。用100%叔丁醇置换乙醇后置于-20℃，使用冷冻干燥机进行干燥，喷金60 s之后可进行扫描电镜观测。
生长和代谢参数计算
根据氨氮浓度、亚硝态氮浓度以及古菌16S rRNA基因拷贝数作出1个周期内的生长和代谢曲线图。细胞的最大比增长速率和最大比氨氧化速率根据文献[]中的方法进行计算。
AOA的富集培养
原始污泥经检测含有AOA，进行初始接种之后，在最初的两个培养周期之内，培养基的氨氮浓度在两周之内降低到了接近于0的水平，氨氮降解速率较高。然而在第3个周期的培养中，氨氮降解速率变缓，在历时近200 d的培养之后氨氮浓度才达到传代要求(80%氨氮被降解)。经PCR检测，第3个周期末期古菌amoA基因和古菌16S rRNA基因均呈较强的阳性，表明培养基中的AOA已经大量增长。从第4个周期开始，氨氮降解一般在3-4周的时间内完成。之后继续采用连续传代的方法进行富集，迄今为止一共进行了2年多的培养。
AOA的富集效果检测 2.2.1 &&&&AOB的存在性检测：对第5个周期之后多个时段的富集物进行检测，针对细菌amoA基因进行PCR扩增，均未见条带。此外，针对细菌16S rRNA基因进行克隆文库测序，在随机挑选的29个单克隆序列中，并未发现与AOB亲缘关系较近的序列。由此可证明富集体系中并不含AOB，AOA是唯一的氨氧化微生物，也是体系内氨氧化反应的全部贡献者。2.2.2 &&&&古菌的单一性判断：使用PCR-DGGE对不同时间段的古菌16S rRNA基因多样性进行检测，结果如图 1所示。经过长时间的选择性培养，到第690天时，DGGE图谱显示只有唯一的一个条带a。经切胶测序，峰形单一，不含非特异信号，为单一序列(552 bp,GenBank序列号KP053272)。经初步比对分析确认是AOA序列。
富集培养过程中的古菌16S rRNA基因DGGE图谱变化
The changes of DGGE profile for archaeal 16S rRNA gene during enrichment. Lane 1 stand for enrichment sample from Day 0 (original sludge); lane 2 from Day 21; lane 3 from Day 44; lane 4 from Day 400; lane 5 from Day 690.
此外，针对第690天的样品进行古菌16S rRNA基因(20F/1492R引物)克隆文库分析，随机挑取的53个单克隆测序结果高度一致(相似度在99.7%之上，有不超过3个碱基的突变，可认为在PCR扩增的误差之内)，测序结果经过比对为AOA序列(1439 bp，GenBank序列号KP027212)。且该序列的中间部分与DGGE测序得到的序列比对一致。综合DGGE和克隆文库的结果，可断定富集物中的古菌仅有唯一的一种，该种经确认是AOA，在本研究中命名为HJ-2b。2.2.3 &&&&AOA在培养体系中的纯度：本研究尝试采用平板分离和极限稀释(dilution to extinction)等方法纯培养AOA，但没有获得成功。培养基中仍然有少量细菌存在。使用定量PCR进行分析，在每1 mL培养基中，古菌16S rRNA基因的拷贝数为(3.33±0.82)×108，细菌16S rRNA基因的拷贝数为(
2.52±0.39)×107，古菌拷贝数比细菌高一个数量级。假设每个细胞含有1个16S rRNA基因拷贝数[]，则古菌占培养体系中所有原核生物(古菌+细菌)的比例为93%。由于古菌全部是HJ-2b菌，该结果表明在本研究构建的培养体系中，该AOA得到了高度的富集。
采用细菌16S rRNA基因克隆文库测序对培养体系中的杂菌种类进行分析，针对第690天样品，一共得到29条序列。结果表明体系中杂菌全部属于α-变形菌纲，其中最多的属是鞘氨醇单胞菌属(62%)，其次还有少部分的慢生根瘤菌属(17%)以及不粘柄菌属(14%)。未发现AOB以及亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing bacteria，NOB)的存在。
富集AOA的系统发育鉴定 2.3.1 &&&&基于16S rRNA基因的系统发育地位鉴定：将克隆文库得到的古菌16S rRNA基因序列(1439 bp)用BLAST数据库比对，做出的系统发育树如图 2所示。本研究富集得到的HJ-2b菌与之前报道的Nitrososphaera sp. JG1[]最为接近，在覆盖度为94%时序列相似度为100%；其次与Nitrososphaera evergladensis SR1[]较为接近，覆盖度99%时，序列相似度为99%。依据16S rRNA基因进化关系进行鉴定，HJ-2b菌与上述两株已报道的AOA为同一个属，即Nitrososphaera属。此外，根据AOA研究中常用的古菌分类方法，HJ-2b属于GroupI.1b组，该组内的AOA大多数来源于土壤环境。
基于古菌16S rRNA基因(1439 bp)构建的系统发育进化树
Phylogenetic tree generated from alignments of archaeal 16S rRNA gene sequences by means of neighbor-joining. Numbers in parentheses represent the accession numbers in GenBank. Significant bootstrap values higher than 50% are shown at branch nodes. Scale bar represent 2% estimated sequence divergence.
2.3.2 &&&&amoA 基因的系统发育分析：对同样的样品使用古菌amoA基因引物(23F/616R)进行扩增。PCR产物直接测序和克隆文库测序(39个单克隆)得到的序列完全一致(630 bp，GenBank登录号KP027213)。用
BLAST数据库比对建树之后进化关系如图 3所示。与16S rRNA基因不同，amoA基因比对的结果显示HJ-2b与Nitrososphaera sp. JG1进化关系距离较远，二者相似度只有72%。而与HJ-2b进化关系最接近的一株AOA是Nitrosopumilus maritimus[]，相似度为83%。按照比对结果，HJ-2b的amoA基因属于AOA的另外一个分支：GroupI.1a组，该组AOA成员大部分来自于海洋环境。HJ-2b的16S rRNA基因和amoA基因在系统发育归属上产生了较大差异。
为了排除由于amoA基因引物的选择性对结果产生干扰的可能，本研究使用了另外一对引物amoAF/amoAR对样品amoA基因构建克隆文库，随机挑选了16个单克隆进行测序，得到的序列唯一，且与23F/616R得到的序列有效部分完全一致，归属于GroupI.1a组。
基于古菌amoA基因(630 bp)构建的系统发育进化树
Phylogenetic tree generated from alignments of archaeal amoA gene sequences by means of neighbor-joining. Numbers in parentheses represent the accession numbers in GenBank. Significant bootstrap values higher than 50% are shown at branch nodes. Scale bar represent 5% estimated sequence divergence.
为排除样品随机性的影响，本研究又选取了第690天之后其余两个周期的AOA富集样品再次进行16S rRNA和amoA基因的系统发育分析，得到的结果与之前一致。16S rRNA和amoA基因仍然处于不同的进化分支。
富集AOA的细胞形态观察
使用扫描电镜对富集后的培养基进行观察，视野中大多数细胞为如图 4所示的杆状细胞，可认为该细胞就是富集得到的HJ-2b菌。细胞大小为
(1.0±0.2)μm×(0.30±0.04)μm。与Nitrososphaera sp. JG1细胞形态(球状)差异较大，与Nitrosopumilus maritimus相比形状和大小则较为接近。
富集物中HJ-2b菌的扫描电镜观察(50000×)
Scanning electron microscopy image of enrichment HJ-2b (50000×). Scale bar represent 1 μm,dark pores are from GTTP membrane.
富集AOA的生长和代谢特性
对一个周期内AOA富集培养基的氨氮、亚硝态氮，16S rRNA基因拷贝数和amoA基因拷贝数进行连续监测，得到的结果如图 5所示。氨氮的降解在第10天的时候全部完成，同时生成的亚硝态氮趋于稳定，细胞数(近似用16S rRNA基因拷贝数代替)在第12天时达到顶峰，之后便进入衰退期开始下降。
HJ-2b在一个周期内的生长和代谢情况
The growth and metabolism of the HJ-2b enrichment culture.The error bars represent the standard deviations based on triplicate measurement of one sample.
根据图 5计算得到HJ-2b的生长和代谢速率，如表 2所示。HJ-2b的最大比增长速率为0.43 d-1，代时为1.6 d，该速率比N.maritimus稍低，和其余AOA菌株大致相当，但远低于纯培养的AOB菌株N.europaea。最大比氨氧化速率为3.9 fmol/(cell·d)，稍低于N.maritimus和N.devanaterra，与N.europaea相比差距仍然较大。
为了探究16S rRNA基因和amoA基因的对应关系。在同一周期中我们也同时检测了amoA基因的拷贝数。如图 5所示，amoA基因的变化趋势与16S rRNA基因一致，为了进一步进行比较，我们对两个基因的数目进行了线性回归分析，如图 6所示。两个基因数目变化显著相关，随着AOA的繁殖和衰亡呈现同样的增减趋势。且在此过程中两个基因数的比值基本保持不变，整体上在0.8793约为0.9左右浮动。由此可以排除16S rRNA基因与amoA基因分别来源于两种不同菌的可能，从而也就间接证明了本研究得到16S rRNA基因与amoA基因序列均属于HJ-2b菌的基因组。
表 2. 芦苇生态特征及水盐因子的统计学参数
Table 2. Descriptive statistical parameters of the ecological characteristics of Phragmites australis and water-salt indicators
Specific growth rate(d-1)
Specific ammonia oxidation rate
[fmol/(cell·d)]
Nitrosoarchaeum koreensis[]
Nitrososphaera sp.JG1[]
Nitrosopumilus maritimus[]
Nitrosotalea devanaterra[]
Nitrosomonas europaea[, ]
16S rRNA和amoA基因的对应关系
The relationship between 16S rRNA and amoA gene. The copies of genes are from Figure 5.The error bars represent the standard deviations based on triplicate measurement of one sample.
本研究经过长达2年的富集培养，最终从污水处理系统中得到了以HJ-2b为主的高纯度AOA富集物，后续对HJ-2b生理生化特性的进一步研究将有助于理解AOA在污水处理系统中存在的条件以及发挥的作用。
以通用的16S rRNA基因的进化关系为准，本研究将HJ-2b归于Nitrososphaera属。尽管该AOA与Nitrososphaera sp. JG1的16S rRNA基因相似度达到100%，但在amoA基因的进化关系上却与之相距较远，且细胞形态有较大差异，是不同于Nitrososphaera sp. JG1的一种AOA。
由于以抗生素和自养培养基作为选择压，原始活性污泥中的AOB、NOB被彻底除去，其余细菌大部分被淘汰，古菌只剩唯一的HJ-2b菌，最终达到93%的富集纯度。培养体系中残留的细菌多为异养菌。以鞘氨醇单胞菌属为例，这是一种能降解多种复杂有机物的好氧异养菌，生存能力较强[]。在长期的富集过程中，该菌有可能逐渐具备了较强的抗生素抗性，此外还可能利用了AOA衰亡裂解之后的细胞物质作为营养，最终得以存活下来。其他杂菌的存活原理与此类似，因此之后要杀灭残留的细菌，则需要选用其他种类的细菌抗生素进行进一步的探索。
本研究经过尝试最终未能获得AOA的纯培养菌种，一方面是因为残留的杂菌难以被去除，另一方面也与AOA的生存方式存在一定的关系。据相关报道，AOA并非完全都是严格的自养菌，有时也会利用有机物进行生长。如N.viennensis在丙酮酸存在时生长较快，在完全自养条件下生长速率则大幅下降[]。有的AOA会与特定种类的细菌共生，如硫氧化菌等，在去除细菌之后便无法生存[]。因此本研究富集得到的AOA有可能与杂菌共生，利用杂菌的代谢产物作为营养物质。在不清楚这些营养物质的具体种类时，很难将AOA与杂菌分开来单独培养。
HJ-2b的代时为1.6 d，约为38 h。且该数据是在实验室条件下测定得到的，在实际的污水处理系统中，比生长速率会更慢，代时会更长。而AOB的代时一般在7-36 h[]之间。相比之下AOA在实际情况下的代时比AOB要长，这可能是在很多污水处理系统中只存在AOB的原因。较短的污泥停留时间导致AOA不能够充分增长，最终流失。因此，如果要将AOA应用在实际的污水处理中，可能需要采用添加填料或进行菌体固定化等方法来减缓AOA的流失速度。此外，可将AOA应用于低氨氮污水或者饮用水的处理，发挥AOA对氨氮具有较高亲和力的优势[]。
HJ-2b在16S rRNA基因和amoA基因的进化关系上产生了较大的差异，换用不同的引物检测之后，该差异仍然存在。这是在之前的AOA富集中从未被报道过的。Pester等认为AOA的amoA基因和16S rRNA基因是共同进化的[]，同一种AOA的两个基因都应该归于到同一个组，即同为GroupI.1a或者同为GroupI.1b。而本研究得到的HJ-2b菌的16S rRNA基因归属于GroupI.1b，而amoA基因归属于GroupI.1a，与Pester的理论矛盾。考察该菌的原始生存环境，一种可能的解释是HJ-2b菌的amoA基因并不是其本身具有的，而是来自于横向的基因转移。因为该菌是从污水处理系统中富集得到的。相比于土壤和海洋等自然环境，污水处理系统环境更为复杂，由于营养物质丰富，微生物密度高，导致它们的功能基因之间发生横向转移的可能性也更大[]。有研究者在膜生物反应器(MBR)中就发现不同细菌之间存在抗生素抗性基因的横向转移现象[]。而AOA作为古菌的一种，其在上亿年的进化过程中基因转移现象也较为普遍[]。因此我们猜想HJ-2b菌的amoA基因最初有可能是来自于另外一个属于GroupI.1a的AOA(称为供体AOA)。接受了基因转移后的HJ-2b，其氨氧化活性更能够匹配之前具有的一些性质(比如菌体大小，细胞膜通透性等)，因此相比而言更能够适应污水处理系统环境以及本研究采用的培养基条件，最终得以富集。而供体AOA虽然具有同样的amoA基因，但由于与整个菌体的其他性质不匹配，不适应富集条件而最终被淘汰。
考虑到本研究仅就HJ-2b的两个基因进行了分析，并未涉及其他更多的基因。在今后的研究中，进行全基因组测序尤为必要。由此能够更进一步地明确不同基因的分类归属，进而研究该菌整体的进化关系。
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