西瓜ClIMP基因的功能鉴定--《浙江大学》2013年硕士论文
西瓜ClIMP基因的功能鉴定
【摘要】：低温胁迫是影响植物生长发育常见的逆境因子,也是造成农业减产的主要原因之一。西瓜(Citrullus lanatus)是喜温作物,在早春设施栽培时,常常会受到低温的不良影响,是制约我国西瓜产业化发展的主要因素之一。研究西瓜耐低温相关基因以及低温胁迫响应机制对于揭示西瓜耐低温机理,培育耐低温西瓜种质具有重要意义。随着分子生物学的发展,利用转基因技术提高作物抗逆性具有重要的理论与经济意义。本研究工作的关键在于对西瓜耐低温及抗逆基因的鉴定及分子机理的认识。此前,我们从构建的低温(10℃)胁迫下耐低温西瓜种质(IVSM-9)表达文库中筛选到一个未知功能基因,发现它可以被低温诱导表达。然后我们克隆到该基因的全长cDNA序列,经Blast比对发现其与拟南芥一个膜蛋白(Integral Membrane Protein)基因(AT3G55390)同源性较高(属于unknown functio(?)基因),命名为ClIMP。
为阐明该基因的功能,我们克隆到该基因的开放阅读框ORF序列,构建了过量表达载体并转化拟南芥,获得了转基因T2代植株。同时从拟南芥种质资源中心(Tair)鉴定到一个T-DNA插入的ClIMP同源基因的突变体at3g55390,通过对过量表达ClIMP、at3g55390突变体与野生型拟南芥的耐冷性试验和生理生化指标的测定,验证该基因在低温胁迫中的功能。同时也初步研究了ClIMP基因在盐胁迫、渗透胁迫等非生物胁迫中的功能。主要研究结果如下：
1ClIMP基因受低温胁迫诱导表达,过量表达ClIMP基因可以提高植株耐低温能力。
低温胁迫下,过量表达ClIMP基因能提高拟南芥存活率,表现出较强的耐低温胁迫能力；电导率测定结果证实在细胞水平上,过量表达ClIMP基因显著减轻低温胁迫带来的伤害；渗透势和脯氨酸(pro)的测定结果表明,低温条件下过量表达ClIMP基因拟南芥比野生型拟南芥中合成的渗透物质多；冷诱导基因在过量表达ClIMP基因植株比野生型拟南芥中的表达量要高。
2ClIMP基因可能在盐胁迫下调控中起重要作用。
在盐胁迫条件下,野生型和过量表达ClIMP基因拟南芥发芽率稍微降低,但影响较小,而at3g55390突变体的发芽率显著降低；此外,过量表达ClIMP基因和野生型拟南芥的主根长和侧根数都高于at3g55390突变体。这表明ClIMP基因可能在盐胁迫调控中起重要作用。
3ClIMP基因可能不参与植物在渗透胁迫下的响应过程。
在渗透胁迫条件下,at3g55390突变体、野生型、过量表达ClIMP基因拟南芥的生长情况基本没有差异；根长和侧根数也无显著差异。
【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：S651【目录】：
致谢6-7摘要7-8Abstract8-10缩略词表10-151 前言15-25 1.1 低温胁迫和植物耐低温机理的研究进展16-21
1.1.1 低温对植物的伤害16-20
1.1.1.1 低温对植物细胞膜的伤害17-18
1.1.1.2 低温胁迫下相关物质合成增多18-19
1.1.1.3 低温胁迫下信号转导及诱导基因表达的调控19-20
1.1.2 低温对西瓜的伤害20-21 1.2 关于Gateway技术21-24
1.2.1 Gateway技术介绍21-22
1.2.2 Gateway技术原理22-24 1.3 研究的目的、意义24-252 材料与方法25-41 2.1 试验材料25
2.1.1 植物材料25
2.1.2 菌株和载体25 2.2 主要试剂25-26 2.3 西瓜耐冷相关基因ClIMP的生物信息学分析26-27
2.3.1 开放阅读框ORF查找26
2.3.2 蛋白质保守结构域预测分析26
2.3.3 氨基酸一级结构和理化性质等的预测分析26
2.3.4 同源性搜索和进化树分析26-27 2.4 ClIMP基因低温表达分析27-29
2.4.1 总RNA的提取27-28
2.4.2 cDNA第一链的合成28
2.4.3 ClIMP定量表达分析28-29 2.5 ClIMP基因开放阅读框的克隆29-31
2.5.1 PCR产物回收纯化30
2.5.2 回收产物与载体的连接30
2.5.3 转化大肠杆菌30-31
2.5.4 重组子的筛选及测序31 2.6 植物表达载体的构建31-34
2.6.1 质粒提取31-32
2.6.2 入门载体的构建32-33
2.6.2.1 克隆基因两侧引入attB重组位点32
2.6.2.2 BP反应32-33
2.6.2.3 转化大肠杆菌感受态33
2.6.2.4 重组子的筛选33
2.6.3 表达载体的构建33-34
2.6.3.1 LR反应33
2.6.3.2 转化大肠杆菌感受态33
2.6.3.3 重组子的筛选33-34
2.6.3.4 表达载体的酶切验证34 2.7 质粒转化农杆菌34-35
2.7.1 农杆菌感受态细胞的制备34
2.7.2 表达载体质粒转入农杆菌34-35 2.8 花序浸染法转化拟南芥35 2.9 转基因拟南芥的鉴定35-37
2.9.1 抗性培养基筛选转基因拟南芥35-36
2.9.2 转基因拟南芥的PCR鉴定36
2.9.3 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定36-37 2.10 At3g55390突变体的鉴定37
2.10.1 纯合突变体鉴定37
2.10.2 At3g55390基因敲除鉴定37 2.11 低温胁迫下拟南芥的性状分析37-40
2.11.1 低温胁迫下拟南芥表型37-38
2.11.2 相对电导率测定38
2.11.3 渗透势测定38
2.11.4 脯氨酸含量测定38-39
2.11.5 冷诱导基因的表达39-40 2.12 盐胁迫下拟南芥的性状分析40 2.13 渗透胁迫下拟南芥的性状分析40-413 结果与分析41-58 3.1 西瓜耐冷相关基因ClIMP的生物信息学分析41-44
3.1.1 ClIMP基因全长序列41
3.1.2 序列翻译和开放阅读框ORF查找41-42
3.1.3 蛋白质保守结构域预测分析42-43
3.1.4 氨基酸一级结构和理化性质等的预测分析43
3.1.5 同源性搜索和进化树分析43-44 3.2 ClIMP基因低温表达分析44-45 3.3 ClIMP基因开放阅读框的克隆45-46 3.4 植物表达载体的构建46 3.5 转基因拟南芥的鉴定46-48
3.5.1 抗性培养基筛选转基因拟南芥46-47
3.5.2 转基因拟南芥的PCR鉴定47
3.5.3 转基因拟南芥的RT-PCR鉴定47-48 3.6 At3g55390突变体的鉴定48-49 3.7 低温胁迫下拟南芥的性状分析49-55
3.7.1 低温胁迫下拟南芥表型49-52
3.7.2 相对电导率测定52
3.7.3 渗透势测定52-53
3.7.4 脯氨酸含量测定53-54
3.7.5 冷诱导基因的表达54-55 3.8 盐胁迫下拟南芥的性状分析55-57 3.9 渗透胁迫下拟南芥的性状分析57-584 讨论58-605 结论与展望60-61 5.1 结论60 5.2 后续工作展望60-61参考文献61-68附录一 常用培养基和相关试剂的配制68-69附录二 pMD 18-T Vector载体图谱69附录三 入门载体pDONR221载体图谱69-70附录四 表达载体pMDC32载体图谱70
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打针西瓜被证实不存在 盘点不靠谱的食品谣言
&&&&& &打针西瓜&是指被注射了食品添加剂甜蜜素和胭脂红之后，经人工催熟的西瓜。此类西瓜的保质期比正常西瓜短，长期食用对人体健康有害。2012年5月，&打针西瓜&的消息在微博上广为流程，引起不小惊恐，但不断有专家、学者出来辟谣称，打针西瓜操作难度大、成本高，打过针的西瓜保持不久，绝对不可能出现在市场上。
　　昨日，微博的网友&王强_99&在微博上称：&黑心商贩把针头对准了尚未到成熟期的西瓜，&打针西瓜&所注射的禁用食品添加剂&&甜蜜素和胭脂红!&&&，并且还附带了打过针的西瓜照片。
　　《春城晚报》对此进行了暗访，记者称找到了一户西瓜批发商，假意要批发麒麟瓜去卖，这户商贩也向记者介绍，现在的西瓜，很多下地的时候其实都还没有完全成熟，还有夹生的，都需要打甜蜜素，这已经是行业里&公开的秘密&了。该批发商还介绍，买了他的瓜以后，不要急于一次把甜蜜素打进去，而是应该在准备零售以前1至2天的时候再打，这样西瓜出售时的状态最好，时间长了，西瓜就不好吃了，水分和瓜瓤就会发生分离。最后，这名经销商继续向记者介绍：&除了西瓜，还有橙子、柚子这样的水果，都很容易用注射方式添加甜蜜素。&
　　但是也有许多不同的媒体对此表达了看法。《现代快报》记者为了检验这个传言是否属实，专门一家水果店购买了两个西瓜，对其中一个西瓜进行了&注射胭脂红、甜蜜素溶液&的尝试。他发现射了&添加剂&溶液的西瓜，味道确实非常甜，但入口后，开始逐渐有酸涩味道，并且，这种酸涩味在吃下去后也久久不散。正常的西瓜，瓜瓤一般清甜可口，吃下去后，也不会有任何异常味道留在口中。&打针西瓜&和正常的红瓤西瓜，在颜色和口味上，还是能轻易辨别的，&打针西瓜&要想骗过消费者并非易事。
　　&据我判断，杭州出现打针西瓜的可能性不大。&浙江省农业科学院蔬菜研究所研究员范敏博士在看了网上热传的打针西瓜图片后称：&注射过添加剂的西瓜很容易变质、瓜肉糜烂，尤其是夏天，常温下24小时就会烂掉。&而且，由于无法使注射的液体均匀扩散、挨个注射费工费力等原因，实施起来很困难。因此，很难想象有果农和商贩会这么去操作。
　　五大不靠谱的食品谣言
　　1.非油炸比油炸食品健康?
　　以方便面为例，油炸方便面需将面饼用沸油炸制干燥，而非油炸方便面则直接用热风烘干。中国农业大学食品科学与营养工程学院副院长胡小松教授强调，非油炸只是一个卖点，远没有想象的那样健康。
　　首先，无论制作工艺如何，油炸和非油炸淀粉类食品都含有致癌物丙烯酰胺。中国疾病预防控制中心营养与食品安全所专家吴永宁指出，没有发现油炸方便面比非油炸方便面的丙烯酰胺含量更高。
　　其次，无论是不是油炸，膨化类食品都会添加大量调味剂，包括甜味剂、谷氨酸钠、盐等。其中仅食盐一项，长期过量摄入就会增加心血管病风险。
　　此外，这类食品中添加的硫酸铝钾或硫酸铝铵等膨松剂，长期摄入会造成体内铝超标，诱发老年痴呆、骨软化症等。
　　2.鸡精比味精更天然?
　　其实，鸡精的主要成分还是味精，只是味精是单一的谷氨酸钠，而鸡精是一种复合调味料，其中的谷氨酸钠含量在40%左右。鸡精中除了味精之外，还有淀粉(用来形成颗粒状)、增味核苷酸(增加味精的味道)、糖、其他香料。从这一点说，鸡精并不比味精更健康。
　　3.天然的食物不会掉色?
　　有的人认为红苹果怎么洗也不掉色，所以，天然的食物是不会掉色的。其实，天然的食物也是会掉色的。但是每种食物所含的色素不同，因此也具有不同的特性。通过实验表明：天然的黑芝麻、紫米、花生豆都会给淘洗的水染色，破损的草莓也会染红水，这不能说明是用人工色素染色的结果。
　　4.圣女果是转基因食品?
　　最近网上有传言说圣女果是转基因食品，食用后可能会对人体产生影响。对此，西安市农业局副局长张贵生明确表示：圣女果不是转基因食品，可以放心食用。西北农林科技大学副教授刘建辉表示，圣女果属于番茄，从台湾引种，只不过第一个引种的品种名是&圣女&，所以人们后来把所有小西红柿都称为&圣女果&。
　　5.无糖食品比含糖食品健康?
　　无糖食品不能加入蔗糖和来自于淀粉水解物的糖。但是，它必须含有相应于糖的替代物，但是，如果加糖醇和低聚糖，成本会比较高。于是，我国大部分产品都转向了高效甜味剂，比如安塞蜜、甜蜜素、糖精等。这些东西既和白糖一样会快速升高血糖，又和白糖一样容易令人发胖。
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＞＞＞阅读下面文章，完成以下题目转基因作物同普通植物的区别只是多了..
阅读下面文章，完成以下题目转基因作物同普通植物的区别只是多了能使它产生额外特性的基因。早在1983年，生物学家就已经知道了怎样通过生物工程技术将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去，以便使它产生靠杂交方式根本无法获得的某种新的特性：抗除莠剂的特性、抗植物病毒的特性、抗某种害虫的特性等。用以移植的基因可来自任何生命体：细菌、病毒、昆虫等。转基因作物目前在世界上已种植有1000万公顷左右，种植最多的是棉花、玉米和西红柿等。在实验室试种的还有莴苣、西瓜、稻谷等品种。试验的目的除了增产之外，还在于提高这些品种的抗病毒能力。但同时也有专家担心转基因作物可能对环境有危险。【比如在美国栽种的那种能抗虫害的玉米和棉花，可能加快出现一些更难对付的害虫。这类作物的所有分子都分泌出一些微量的"杀虫药"，一种像任何一种农药一样能选杀死某些害虫的"雾剂"。】尤其是那些能抗除莠剂的作物，它们一旦同野生状态下的"表姐妹"杂交之后，那些"表姐妹"也就会因此而成为除莠剂无法除掉的变种了。对于这种技术，尽管还有些问题需要继续研究，但这确实是人类9000年作物栽培史上一场空前的革命。小题1:根据文意，对"转基因作物"的理解，正确的一项是(&&& )。A．因环境影响脱氧核糖核酸的变化而产生额外特性的作物B．能够产生抗除莠剂、抗植物病毒等额外基因的作物C．一种利用移植其他生命体基因而形成的新的杂交作物D．移植了其他生命体基因从而产生额外特性的作物小题2:对文中画线处的意思理解，正确的一项是(&&& )。 A．新害虫的出现与能抗虫害作物分泌的"雾剂"污染环境有关 B．美国的那种基因的玉米和棉花品种是无法对付害虫的 c．能抗虫害的玉米和棉花可能促使更不容易杀死的害虫出现 D．那种能抗虫害的作物，在抗虫害的同时，又保护了一些害虫小题3:下列说法，符合原文意思的一项是(&&& )。 A．转基因作物的研究已取得突破性进展，目前所有品种都得到推广种植 B-提高作物抗病毒的能力仍然是转基因技术研究没有完全解决的问题 C．更难对付的害虫的加快出现将是转基因作物给环境带来的最大危险 D．增产并不是转基因技术研究的目的，提高抗病毒能力是研究者最感兴趣的小题4:对文中所提供的信息，理解不准确的一项是(&&& )。 A．生物学家知道怎样通过转基因技术使作物产生抗除莠剂等特性不过二十多年时间 B．转基因作物可能给环境带来危险是转基因技术研究中不容忽视的问题 c．野生植物同抗除莠剂作物杂交之后的变种已经给农业生产带来新问题 D．转基因是一种新的生物工程技术，它给作物栽培带来从未有过的根本改革
题型：阅读理解与欣赏难度：中档来源：不详
&25．小题:D小题:C小题:B小题:C小题:转基因作物是一种人工产物，所以A、B均不正确；转基因作物不是杂交作物，所以C不正确；转基因作物有两个特点：一是具有额外特性；二是所转入基因来自其他任何生命体，D正确。小题:画线句子的意思是：这些转基因作物分泌出的"杀虫药"会增加某些害虫的抗药性，所以这些害虫将不容易被再杀死，答案为C。小题:根据第二段第二句可知还有不少作物仍只是在实验室试种，所以A不正确；更难对付的害虫加快出现只是转基因作物对环境的某一种可能危害，并不一定是最大危害，文中并没有指出比较的对象，所以c错误；提高抗病毒能力、增产、增加抗除莠剂特性等都是转基因作物的研究目标，难分轩轾。小题:抗除莠荆作物并不是与所有的野生植物都会杂交，而只是与野生状态下的某些同类植物杂交，并因此产生变种，所以C表述有误。
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据魔方格专家权威分析，试题“阅读下面文章，完成以下题目转基因作物同普通植物的区别只是多了..”主要考查你对&&现代文阅读&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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现代文阅读
现代文阅读掌握内容：各种文体有不同的命题规律和答题技巧，不能一概而论。相对来说说明文和议论文命题方向更集中，答题的格式也相对固定，规律性更强些。解题注重技巧。记叙文题型更丰富些，答案也更灵活。重在感悟和语言的表达。一、首先：表达方式、修辞手法、常见写作方法、表现手法、描写方法、说明方法、说明顺序、论证方法这些重要要素一定要把握住。　　二、其次：（1）语句在文章篇章结构上的作用：总起全文、引起下文、打下伏笔、作铺垫、承上启下（过渡）、前后照应、首尾呼应、总结全文、点题、推动情节发展。　　（2）语句在表情达意方面的作用：渲染气氛、烘托人物形象（或人物感情）、点明中心（揭示主旨）、突出主题（深化中心）。　　（3）语句特色评价用词：准确、严密、生动、形象、深入浅出、通俗易懂、语言简练、简洁明了、言简意赅、富有感染力、节奏感强、委婉含蓄、意味深长、发人深省、寓意深刻、引发阅读兴趣、说理透彻、有说服力。　　（4）文段中关键词语、短句的分析：在题目的题干中出现了加引号的词语或句子，往往表明分析的对象源出于原文，在分析时应贯彻这样的原则：词不离句→句不离段→段不离篇。也就是说一定要结合具体语境来考虑。　　（5）理解词语在选文中的意思和在语境中的含义：解答这类题目，要注意两点：一是这个词可能不再具有词典中的含义，而是特定语境中的特殊含义。二是要理解词语的语境含义首先必须正确理解词语所在的语境。如《藤野先生》一文中“实在是标致极了”一句中的“标致”。　　（6）语句作用、含义分析题：①评价、赏析一句话：应从两个方面入手，先评写作特色、语言特色，如用了什么修辞手法、表现手法，语言或生动或优美或讲求对称或准确　严密……再评思想内涵，即阐明这一句表达了什么观点，给你什么感受、启迪、教育…… ②分析一句话的含义也可从分析关键词入手，着重体会关键词在特定语境中的含义。　 ③说明文语段中分析一句话，要紧扣住说明内容、说明对象的特征和说明文语言的特色（准确、生动）。记叙文语段中分析一句话，要紧扣住文章所渲染的特定气氛、表达的感情、人物形象的特点等。议论文语段中分析一句话要紧扣住论点（或是全文的中心论点，或是所在段的分论点）以及议论文语言的特色。 ④关键句子主要包括五个方面：点明题旨的句子；描写、议论、抒情的句子；总结全文的句子；起承转合的句子（如相互照应的句子和起承上启下作用的过渡句）；运用各种修辞手法的句子（如比喻、拟人、夸张、排比、对偶、反复、反语、设问、反问，特别是引用的句子）。理解关键句子主要是指能体味句子所表达的思想感情。如作者在字里行间流露出的喜怒哀乐、褒贬态度及思想倾向等。同时要理解句子在文中的功能、作用、特点。　（7）指明语句所用的写作方法：一定要注意文体特征和名词使用的准确性。　　①社会环境描写的主要作用：交代作品的时代背景。在回答时必须结合当时当地的时代背景，指出文段中环境描写的相关语句揭示了什么样的社会现实。　　②自然环境描写（景物描写）句的主要作用：表现地域风光，提示时间、季节和环境特点；推动情节发展；渲染气氛；烘托人物形象（或人物心情、感情）；突出、深化主题。　　（8）用自己的话回答问题：①这种题目往往就是限定不能直接原文中的语句来回答，从另个层面上来说，也就是暗示你原文中有相关语句，所以首先应该找出原文中的相关语句；②其次要考虑的就是如何将原文中的语句变成自己的话，可以采用下列方法：概括大意法，适用于原文相关句子较长的情况；解释重点词法，适用于原文语句中有生僻词；变换句式法，适用于原文使用的是疑问、设问、反问的语意未能完全明确的句子，而题目又要求作出明确表达的情况。　（9）根据阅读短文的感受谈自己的看法或体会：用第一人称；采用1+2或1+3的形式，先用一句话概括出自己的看法或体会，再用两三句话谈谈理由，可以摆事实、也可以讲道理，如题目有相关要求，还要注意结合自己的亲身经历。 ①说明方法：常见的说明方法有举例子、分类别、列数字、作比较、画图表、下定义、作诠释、打比方、摹状貌。 ②说明顺序：所谓合理的说明顺序，是指能充分表现事物或事理本身特征的顺序，也是符合人们认识事物、事物规律的顺序。常见的说明顺序有：时间顺序、空间顺序、逻辑顺序等。 ③论证方法：指的是运用论据来证明论点的过程和方法，是论点、论据之间逻辑关系的纽带。常用的论证方法有：举例论证、道理论证（引证法）、喻证法（打比方）、对比法。 ④论点：论点，又叫论断，是作者所持的观点。在较长的文章中，论点有中心论点和分论点之分。　　中心论点，是作者对所论述的问题的最基本看法。是作者在文章中所提出的最主要的思想观点，是全部分论点的高度概括和集中。　　分论点是从属于中心论点并为阐述中心论点服务的若干思想观点。各分论点也需要加以论证。中心论点和分论点的关系是被证明与证明关系。凡经证明而立得住的分论点，也就成为论证中心的有力论据。　　⑤论据：提出论点必须有根据，即必须举出足够的事实或正确的道理，证明论点的正确性。用来证明论点的事实和道理叫做论据。　　论据，依据其本身的性质和特征，可分为事实论据和道理论据（也称事理论据）两类。事实论据是对客观事物的真实的描述和概括，具有直接现实性的品格，因此是证明论点的最有说服力的论据。所谓“事实胜于雄辩”就是这个道理。事实论据包括具体事例、概括事实、统计数字、亲身经历等等。理论论据是指那些来源于实践，并且已被长期实践证明和检验过，断定为正确的观点。 ⑤记叙顺序：顺叙：按照客观事物的发生发展的先后次序进行叙述，从开端、发展、高潮写到结局。倒叙：把事情的结局或后面发生的事情先写出来，然后再按事件的发展顺序进行叙述。插叙：在顺叙的过程中，由于某种需要，暂时把叙述线索中断一下，插进有关的另一件事情的叙述。插叙的作用是补充交代或说明，使叙述更加充分，弥补单凭顺叙难以交代清楚的必要内容，使文章更充实、更周密，在结构上更紧凑。 ⑥描写方法：是用生动形象的语言把人物、事件、景物具体描绘出来的一种手法，给读者以身临其境的感觉。描写是文学创作的基本手法之一。按不同的分类标准描写可以有不同的分法：从描写对象的自然属性来分，可以分为人物描写、环境描写和带综合性的场面描写（兼写人物和场景）。环境描写又分为：自然环境描写和社会环境描写。人物描写还可细分为语言描写、动作描写、肖像描写（外貌描写和神态描写）、心理描写、和细节描写。从描写的角度来分，可以分为正面描写和侧面描写。 ⑦表达方式：表述特定内容所使用的特定的语言方法、手段，是表达方式。它是文章构成的一种形式要素。记叙（叙述）、描写、抒情、议论、说明。 ⑧表现手法：表现手法从广义上来讲也就是作者在行文措辞和表达思想感情时所使用的特殊的语句组织方式。分析一篇作品，具体地可以由点到面地来抓它的特殊表现方式。注：又因为现代的语文已不太注重表现手法与表达技巧的区分，可认为二者是统一的。但如果要严格区分表现手法从属于表达技巧。托物言志、写景抒情、叙事抒情、直抒胸臆、对比、衬托、烘托、卒章显志、象征、想象、联想、照应、寓情于景、反衬、托物起兴、美景衬哀情、渲染、渲染环境、虚实结合、点面结合、动静结合、以动衬静、伏笔照应、设置悬念、侧面描写、正面描写、直接抒情、间接抒情、修辞格、字词锤炼、以小见大、句式选择等。 现代文阅读实用解题技巧：一、解答现代文阅读题应分三步走：
第一步，纵观全文，把握主旨一是理清文章的思路。
文章的每一段、每句话归根到底都是为阐明中心服务的，都归向文章的主旨。平时要学会为文章标段，归纳每段意思，归纳中心思想。往往行之有效。二要找寻、读懂文章中关键的词句。特别是那些体现作者立场观点、反映文章深层次内容、内涵较丰富、形象生动的词句。尤其是文章的开头句、结尾句、独立成段的句子、比喻句、连问句、过渡句、抒情议论句，文章的主旨常常隐含其中。 ①不要急着去做题，在进入题目之前，必须读两遍文章。第一遍速读，作快速浏览，摄取各段大概意思，建立起对文章的整体认识，集中解决一个问题——选文写的是什么？第二遍精读，仔细阅读每句话，揣摩、参悟一些重要的句子、段落，对文章的主旨产生一定的认识。②画出在文章的结构上起过渡、连接作用的词语、句子、段落，画出各段落中的中心句，尤其注意段首、段尾，这些词句往往就是回答问题时需要重点研读的，通过找重要的词句进一步理解文章的思路，结构层次。③心中要有文体意识，找出画龙点晴的句子。作为托物言志类的哲理性散文，在叙述和描写中总有一些议论和抒情的语句，阅读时一定要善于抓住议论抒情的句子去把握文意，尤其注意文章结尾的议论抒情，它们往往就是全文的主旨所在。牢记：欲速则不达。一定要读懂文章再做题，坚决杜绝走马观花式的阅读。
第二步，认真审题，定向扫描做现代文阅读主观题的关键在于准确地审题，抓住了审题这个关键，就找到了答题的诀窍。
现代文阅读的审题，就是要仔细分析题干，把握题目要求，即把握题干中包含的与答案相关的各种信息。这是答题的第一步，也是最关键的一步。题干一般由两个部分组成，一是文章作者的话，一是命题者的话。设置题干的目的，主要是限定答题内容；同时，命题者为了使考生不至于茫然无绪，往往又会在题干中提示答题内容在文中的位置，甚至限定了在哪一段或哪个句子中。这样我们就可以根据题干的提示，找出每一道题的出题点，锁定答题区间，具体到段、句、词。只要找准了原文中的相关区域，认真揣摩上下文的文意，准确抓住关键词句，准确地把握住答案的有关信息，大多数题目的答案是能够在原文中找到的。牢记：题干提示了答题范围，题干规定了答题角度，题干提供了答题思路，题干隐含了答题信息，题干体现了答题规律。
第三步，筛选组合，定向表述文学作品阅读多为主观题，其题干不仅能显示答题的区域，还能显示答题的方式。
要站在命题人所“问”的角度回答问题，问什么答什么，使所答充分、到位、准确、有条理。整合时一定要确保文通句顺。牢记： 1、弄清题干中所具有的态度或倾向遇到的题干如果是否定形式，就采用先反后正的答题方式，避免遗漏要点；遇到的题干如果是肯定形式，就采用正面的答题方式。2、弄清题干语言的构成形式，确定答题语言形式。题干的结构，是表意的外在形式，暗示着语句含义由哪些方面构成，分析结构可以提示考生答题时如何组织好语言。3、弄清题干中作者的话和命题者的话题目中出现作者的语句，一般是学生要理解和分析的对象，而命题者的话一般起到引导学生明确解答重点或者提供限制条件的作用。4、变含蓄为直接，变分说为概括。高考中现代文阅读材料多为散文，语言不仅有丰富的内涵，还很讲究艺术技巧。有的含蓄委婉，有的生动细腻，有的形象具体。具有这些特点的语句在高考中历来成为考查的重点。组织答案的时候首先要整合文中的相关信息，在原文中找出相关段落所传达的信息的共同点，然后利用文中附着信息共同点的那些具体的、形象化的语句，把这些具体形象化的语言转换为抽象，概括性的语言，即为所需答案。5、多从原文中筛选、提炼、整合语句作答。现代文阅读的考查目的在于把握并理解作者在文中所要传达的信息，因此，要依照作者的思路来理解作品，多从原文中寻找答案。但并不是直接摘抄，有时以文章中的词或句为基础略作改写来作答，有时要求综观全文，从各段中提取相关信息加以整合。这类题在高考中出现最多。二、另外，要弄清试题中常用的名词术语。1、表达方式，常用的表达方式有记叙、描写、议论、抒情、说明等。写作手法，考生要清楚，狭义的写作手法即“表达方式”，广义的是指写文章的一切手法，诸如表达方式、修辞手法，先抑后扬、象征、开门见山、托物言志等。2、修辞手法，常用的有比喻、拟人、反复、夸张、排比、对偶、对比、设问、反问等。3、语言特点，一般指口语的通俗易懂，书面语的严谨典雅，文学语言的鲜明、生动、富于形象性和充满感情色彩的特点。分析时，一般从修辞上进行分析。感悟，多指发自内心的感受、理解、领悟等。4、说明文的类型，事物、事理说明文(内容角度)；平实、生动说明文(语言表达角度)。5、说明方法，一般有举例子、分类别、列数据、作比较、下定义、作诠释、打比方、画图表、摹状貌等(一般是三个字)。说明顺序，时间顺序(程序顺序)、空间顺序、逻辑顺序。在答题时，可答得具体些，如：空间顺序(从上到下，从里到外等)，逻辑顺序(先结果后原因，层层递进等)。说明对象，指文章说明的主要人或事物(一般不必答人或事物的特点)。6、论证方法，中学要求掌握的有道理论证、事实论证、对比论证、比喻论证、归谬法。论证方式，立论和驳论。理论论据，包括名人名言、俗语谚语、公式定律等。事实论据，一切事实、史实、数据等。简明，语句简洁、明了，一般有字数上的限制。得体，文明礼貌，人性化。7、有何作用，回答文章中某一内容的作用或好处可从三个方面考虑，一是内容方面，如深化主题、强调感情等；二是结构方面的，如过渡、呼应等；三是语言方面，如引人入胜、生动活泼等。8、思想内容，基本是指文章的中心思想或主旨。9、思想感情，作者或作品中人物所表现出来的思想倾向，如善恶、好恶、褒贬等。以上各“常用术语”，暗中考查语文基础，同时也是题目赋分点所在，考生理解清楚，可很好地根治“答非所问”的弊病。解题方法：
1.纵观全篇把握主旨一篇文章是一个有机的整体。读一篇文章如果没有着眼于全篇的目光，没有整体把握的意识，其结果只能是事倍功半，甚至徒劳无益。因此，阅读效率的提高取决于对文章内容的主旨是否能正确把握。那么，如何把握文章的主旨呢？首先要着眼于文章的整体，注意理清内部的相互关系，从宏观上居高临下地驾驭文章，领会文章的主旨内涵。其次还要看文章的作者、写作时间和文后的注释等，特别要浏览一下后面问了哪些问题，从题目的选项中揣测文章的主旨，明确作者的主要写作意图，这样解题就心中有数了。
2.理清脉络划分层次《报秋》全文共九个自然段，一至六段为第一部分，这一部分的感情脉络是：由玉簪花“探出头来”“报秋”引得作者“一惊”写起，随即“怅然”，又想到玉簪花的顽强、谦让、洁净和特有的芳香，归结到“秋是收获的季节，我却是两手空空”的失落、不安和焦虑。七至九段为第二部分：从兄长寄来的词中有所领悟，悟出“只在心中领取，便得逍遥”的人生哲理，从而坚定“领取生活”的人生态度。
3.检索范围准确摘取良好的阅读素质不仅体现在对文章的整体把握上，还体现在对局部的确认。阅读时，先看题目涉及到文中哪些段落或区域，确定对应的语句，再仔细分析这一段里每一句话的意思，理清段落之间的关系，了解行文思路。阅读题一般是从选文里有可能被学生忽略且又不一定真懂的地方抽出来编成各种形式的问题，用来考查学生的理解能力。因此，答案要从选文里找，只要认真揣摩上下文意，准确抓住关键语句，大多数题目的答案在原文中是能够“抠”出来的。
4.综合分析全面考察有些阅读题要求学生用自己的话把答案意思说出来，且往往有字数限制。这种题对学生语言表达能力的要求比较高，题目难度也大。解答此类试题，要吃透答案的内容要点，吃准表述的范围、角度和方式，用规范的语言表达。
5.认清手法明确作用现代文阅读，命题者常常从文章的表现手法和修辞手法方面出题对考生进行考查。因此，掌握常用的表现手法和修辞手法，明确它们的修辞作用，对理解和鉴赏文章很有帮助。近几年高考现代文阅读大致考查了如下几种修辞手法： (1).比喻比喻要贴切，必须有相似点。本体与喻体的相似点越明显，越突出，比喻就越贴切。(2).拟人搜索(3).反衬(4).对比(5).反复(6).排比(7).象征象征是文艺创作的一种表现手法，用具体的事物表现某种特殊意义，或通过某一特定的具体的形象以表现与之相似的或相近的概念、思想和感情。
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