为什么CDC提出应将大肠埃希菌O157：H7列为常规检测项目?_百度知道
为什么CDC提出应将大肠埃希菌O157：H7列为常规检测项目?
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H7列为常规检测项目,在北美许多地区,所以CDC提出应将大肠埃希菌O157,是从血便中分离到的最常见的病原菌,分离率占血便的40%。
且O157是4岁以下儿童急性肾功能衰竭的主要病原菌,6,最具代表性的是O157:H7占肠道分离病原的第二位或第三位(多于志贺菌和耶尔森菌):H7感染的发生率最高、8三个月O157:H7、7, O157EHEC的血清型＞50种
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出门在外也不愁肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用--《中国人兽共患病学报》2010年07期
肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用
【摘要】：目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R378.2【正文快照】：
肠出血性大肠埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC)主要血清型O157∶H7是引起散发性或暴发性出血性结肠炎的主要致病菌,可产生志贺氏毒素样细胞毒素〔1〕。该致病菌传播途径复杂多样,主要经食品传播,被感染者出现腹泻、呕吐、剧烈腹痛、出血性结肠炎、溶血性贫血
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大肠杆菌O157：H7分子鉴定及其eae基因克隆与表达.pdf83页
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课题来源：
。食品安全关键技术应用的综合示范
国家科技部，项目编号：
+世界银行贷款“高校发展项目”资助
浙江大学硕士学位论文
WHO不久前指出在过去的20年里，世界上出现了约30种新的传染病，1982
年美国首次报告的由大肠埃希氏菌0157：H7引起的出血性肠炎就是其中之一。
已失H0157：H7是一种以食物为主要传播途径的人畜共患病原菌，各种肉类、牛
奶、蔬菜等均可成为传播媒介。其对人的致病力特别强，每次摄入103―104个菌就
会发病，现已引起世界高度关注。未能及时做出病原学诊断，缺乏有效的防控手
段，是导致该菌流行的重要原因。鉴此，建立敏感而特异的检测方法，用于临床
诊断、食品检验和流行病学调查十分必要。
本试验根据大肠杆菌0157：H7O抗原基因簇中特异基因WZX及鞭毛特异
编码基因flic的保守序列设计2对引物，建立并优化了检测大肠杆菌0157：H7
的特异性二重PCR体系。在人工培养基中大肠杆菌0157：H7的检测下限为3
方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉等动物性食品中大肠杆菌0157：
H7的污染。
是该菌的重要毒力因子之一，是细菌粘附宿主细胞所必须的一种外膜蛋白，有可
能是最关键的黏附素，与细菌的毒力密切相关。其作为牛的疫苗有潜在的开发价
值。因此，本试验应用DNA重组技术，对大肠杆菌0157：H7编码紧密素的eae
基因成功地进行了克隆表达，并制备了紧密素多克隆抗体，该抗体经试验验证，
具备一定的特异性，可试用于大肠杆菌0157：H7的免疫学检测。
关键词：大肠杆菌0157：H7；PCR检测；紧密素；WZX基因；∥
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是由多个菌属组成，生物学性状相似，均为革兰氏阴性杆菌，这些细菌常寄居在人和动物的消化道，并随粪便排出体外，广泛分布在水和土壤中，大多数肠道杆菌属于正常菌群。当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时，成为条件致病菌而引起疾病。部分肠道杆菌是致病菌。例如：产毒大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌、各种志贺氏菌可使人患肠道传染病。例&&&&如伤寒沙门氏菌、各种志贺氏菌类&&&&别大肠埃希氏菌
肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157:H7血清型为代表菌株。1、EHECO157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。。
2、EHECO157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；
3、耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；
4、不耐热，75℃1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。
5、EHEC的最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长。
6、EHECO157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义。EHECO157:H7虽然有uidA基因，但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）产生荧光，即MUG阴性。
7、EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定。前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验；后者则应先进行动力试验，动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验。
8、EHECO157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成。B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合，具有毒素活性的A亚单位进入细胞，改变60s核糖体的组分，干扰蛋白质的合成。编码VT的基因位于噬菌体上，可缺失而不产生VT。美国俄勒岗州和密执安州，因食用汉堡包引起的食物中毒的病人粪便中被分离并命名的。据美国疾病控制中心(CDC)报告，每年全国约发现2万多例病人。死亡人数200-500人，以后陆续在全球五大州20多个国家被发现或引起暴发和流行。自82年发现至今，发生规模最大的一次爆发是97年5月下旬，日本冈山、广岛等县几十所中学和幼儿园相继发生6起集体食物中毒事件，人数多达1600人，导致3名儿童死亡，住院儿童达80人。同时日本仙台和鹿儿岛形成中毒人数过万人，死亡11人，波及44个都府县的爆发性食物中毒，引起全世界的关注。此外美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、苏格兰、威尔士等国家和地区也相继报道了EHEC的散发性感染和暴发流行。
我国1988年首次分离到E.coli O157:H7。从已有的流行病学调查资料看，我国也存在散发病例，还没有爆发流行的报道。近几年也通过监测，先后从牛、猪、羊、粪便，肉类等食品中查到E.coliO157:H7。
日，德国明斯特大学医院26日宣布，该院卫生研究所经调查确认，近日在德国暴发的肠出血性大肠杆菌（EHEC）疫情是由一种名为“Husec41”的肠出血性大肠杆菌变种引起。这一少见的变种对很多抗生素具有抗药性。与此同时，德国汉堡卫生研究所已查明这种病菌的一个来源是产自西班牙的黄瓜。1.季节性：多发生于夏秋两季6-9月为发病高峰。11月至次年2月极少发病。
2.地区分布：多发生于发达国家，主要以散发性为主。
3.易感人群：儿童5-9岁、老人50-59岁明显高于其它年龄组，最小3个月，最大85岁。
4.宿主：农场动物牛、羊、猪、鸡、马、鹿、鸽子、海鸥等均可能为大肠杆菌
O157的携带者。
5.食源性E.coliO157:H7感染：牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的传播载体。毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成。B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合，具有毒素活性的A亚单位进入细胞，改变60s核糖体的组分，干扰蛋白质的合成。编码VT的基因位于噬菌体上，可缺失而不产生VT。(2)出血性结肠炎(HC)
(3)溶血性尿毒综合症(HUS)
(4)血栓性血小板减少性紫癜(TTP)
E.coliO157:H7的感染剂量极低。伏期为3-10天，病程2-9天。通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，可发热或不发热。部分患者可发展为HUS、TTP等，严重者可导致死亡。(一)国标法（常规法）
1、增菌培养
(二)金标试纸法
该方法是中华人民共和国卫生部频布的“关于全国肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻应急处理预案”中的指定方法。
将样品经过特殊的前增菌及增菌后，取120ul的增菌培养液放入试纸夹的样品槽中，样品由于毛细管作用移至反应区，反应区中含有特殊的抗体(E.coliO157:H7抗体)它与胶体金颗粒共轭偶联。如果样品中存在抗原，将同金标抗体结合形成抗原-抗体复合物，沿着硝酸纤维素膜向前移动至含有固定的抗E.coliO157:H7抗体区域(T区)，金标免疫的复合物与该区域的抗抗体发生特异性结合形成一条可见的线。其它的样品继续移动到膜的未端，最终进入废物池被遗弃。
反应区也含有金标结合的一种专利抗原(颜色指示剂)，不管样品中有没有E.coliO157:H7抗原，它都被样品洗脱。金标控制指示剂通过膜移动到阴性控制区与专利抗体结合形成一条可见的线。无论样品中有没有E.coliO157:H7抗原，控制线都将在控制区(C区)形成，来确保试验正常进行。
增菌液滴入8-10分钟后，观察试纸C区和T区有无明显的线。在C和T区都有可见的线，则结果为阳性。C区有线、T区无线，则结果为阴性。如C区无线，无论T区有没有线，则实验无效。
（三)ISO－GRID检测系统
ISO－GRID检测系统是一种基于疏水性网膜（HGMF）的过滤系统。该系统通过使用这种含有1600个小方格的滤膜，来对微生物进行检测或计数。
首先，稀释的样品通过5um的不锈钢预过滤器过滤，过滤掉可能引起微生物分析误差的样品残渣颗粒。
然后，样品通过流水的滤膜过滤。再将滤膜放在特异性的琼脂培养板上培养，以检测目标微生物。培养完成后，在膜上检测目标微生物，并记录阳性区域的数量。
滤膜不会染上琼脂培养基的颜色，从而很容易地区别微生物，并进行鉴别和记数。此方法快速简便，重复性好，而且，除大肠杆菌O157﹕H7外，还适用于沙门氏菌、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的检测和计数。
(四)单克隆酶联免疫分析筛选方法
该方法是对所有食品E.coliO157:H7的存在进行筛选，不是确证试验，因为试验中所用的单克隆抗体可能与少部分的非E.coliO157:H7有交叉反应。
阳性的检疫结果应是客观的，必须配有450nm滤光片的光度计来进行测试。只有当阴性和阳性对照均有可接受的光密度读数时，阳性结果才是有效的。
原理E.coliO157:H7原的检测是基于用特异性单克隆抗体进行的酶免疫分析(EIA)。用抗E.coliO157:H7抗原的单克隆抗体包被于聚苯乙烯微量小孔的内表面，将样品和对照加入小孔中。样品中如有E.coliO157:H7抗原存在，则将被吸附在孔上的特异性抗体吸收。冲洗后，加入结合剂与被抗体吸收的E.coliO157:H7抗原结合。再冲洗小孔，除去未结合的结合剂，然后再加入酶底物。当用终止液终止反应时，出现的蓝色则转变为黄色。样品中是否有E.coliO157:H7抗原取决于颜色产生的光密度。
(五)自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）筛选法
此E.coliO157:H7的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器。SPR包被有高特异的单克隆抗体混合物。将一定量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定时间内循环于SPR内外。如果有E.coliO157:H7抗原存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，其他没有结合上的化合物被冲洗掉。结合有碱性磷酸酶的抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的E.coliO157:H7抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉。底物—4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转换成荧光产物—4-甲基伞形酮。荧光强度由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出每一个被测样品的阳性或阴性结果报告。
(六)E.coliO157:H7快速酶触反应显色培养基法
快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，成为今后微生物检测发展的一个重要发展方向。
(七)DNA探针技术
DNA探针技术是最新发展起来的一项特异、灵敏、快速的检测方法，但因有一定比例的假阳性反应，故所有阳性结果必须用标准的培养方法加以确证，
原理用特异性的DNA探针进行E.coliO157:H7核糖体RNA（rRNA）的检测。待检样品经前增菌、选择性增菌和后增菌后，溶解细菌。加入标记好的E.coliO157:H7异性的DNA探针用于液相杂交。如果待检样品中存有E.coliO157:H7的rRNA，荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸(polydeoxyadenylicacid,polydA)末端捕获探针将与目标rRNA序列进行杂交。然后把包被有多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(polydeoxyadenylicacid,polydT)(固相)的测杆插入杂交溶液。PolydA和poldT之间进行碱基配对，便于探针捕获：目标杂种核酸分子结合在固体载体上，未接合的探针被冲洗掉。测杆被培养在辣根过氧化物酶-抗荧光素接合剂中。接合剂与存在于杂交检测探针上的荧光素标记物结合，未结合的剂被冲掉。并将测杆培养于酶底物-色原溶液中，辣根过氧化物酶与酶底物反应，将色原转变为蓝色化合物。一旦遇酸反应便停止，色原的颜色变为黄色。在450nm处测量吸收值，吸收值大于临界则表明在待检的样品中存有E.coliO157:H7。
(八)聚合酶链反应(PCR)技术
PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶DNA序列扩增，增加DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年Millus和Cetus发明了最基本的扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法-聚合酶链反应即PCR法。PCR法建立在三步重复发生反应的基础上。①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA；②退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；③酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA成为下次PCR复制的模板。因此每次循环特异性DNA将以双倍量增加。典型扩增经过20～40次循环能引起100万倍的扩增。在PCR反应中引人Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。
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