载体双酶切后，胶回收的效率极低，胶回收试剂盒正常，双酶切后的电泳图也正常， - 分子生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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载体双酶切后，胶回收的效率极低，胶回收试剂盒正常，双酶切后的电泳图也正常，
我也遇到过这种情况，我是多做几个酶切管，切胶后，都放到一个纯化柱内，30-50微升的60度的TE缓冲液分两次加入，这样可以提高双酶切后载体的回收量
不知道能否帮到你 胶回收试剂盒本身就收不回来太多，你可以试试多切点，我一般切60ul的大体系，切5~10ugDNA，然后载体收回来大概能用三四次吧 胶回收kit回收的片段是有限制的，一般的kit好像是回收大于100bp小于4kb
另外，反应体系加大，载体用量增加，参考kit说明书如何得到更高得率（加热buffer什么的） 楼主，你的问题解决了吗，我胶回收浓度只有十几纳克每微升，太低了，我切了200ul的体系才回收这么点 胶回收量本身就低，建议多切几管，回收挂柱子可重复挂几次，希望对楼主有些帮助 胶回收是效率不高的，酶切的时候用大体系，回收最后一步过柱的时候，把好几管的都过到一个柱子里去吧，洗脱液预热一下效果也会好一些 : Originally posted by 夏天的普洱茶 at
楼主，你的问题解决了吗，我胶回收浓度只有十几纳克每微升，太低了，我切了200ul的体系才回收这么点 虫友，你那时的问题怎么解决的？小虫我最近遇到了这一棘手的问题，望指点！不胜感激啊。 : Originally posted by sunny00博博 at
虫友，你那时的问题怎么解决的？小虫我最近遇到了这一棘手的问题，望指点！不胜感激啊。... 载体后来用PCR回收试剂盒回收的，我切下来的片段很小。胶回收浓度本来就很低，一般我都要浓缩的。 : Originally posted by 夏天的普洱茶 at
载体后来用PCR回收试剂盒回收的，我切下来的片段很小。胶回收浓度本来就很低，一般我都要浓缩的。... 质粒也可以用PCR回收试剂盒回收吗?你是用什么方法回收的呢?最后使用水溶的吗？我接下来要做转化需要5-10ug的质粒,是不是得回收好多管啊？ : Originally posted by sunny00博博 at
质粒也可以用PCR回收试剂盒回收吗?你是用什么方法回收的呢?最后使用水溶的吗？我接下来要做转化需要5-10ug的质粒,是不是得回收好多管啊？... 可以用pcr试剂盒回收的，按照说明书作就可以了。你怎么转化那么多质粒？我们都转化几十纳克就长好多。 : Originally posted by 夏天的普洱茶 at
可以用pcr试剂盒回收的，按照说明书作就可以了。你怎么转化那么多质粒？我们都转化几十纳克就长好多。... 谢谢！我做的毕赤酵母的转化，是同通过同源重组整合到基因组的，载体说明书上要求转化那么多。 : Originally posted by 夏天的普洱茶 at
楼主，你的问题解决了吗，我胶回收浓度只有十几纳克每微升，太低了，我切了200ul的体系才回收这么点 我回收的量差不多也是这么多，好像不影响实验，我都是继续做下面的实验了 建议酶切体系加大，回收时重复挂柱，洗脱液加热50度左右。
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E-mail： & QQ：8835100求助---PCR电泳检测后胶回收为什么总洗没了？？ - 分子生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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求助---PCR电泳检测后胶回收为什么总洗没了？？
最近回收一段317bp的小片段，PCR扩增电泳检测条带还挺好的，就做胶回收，使用的是E.Z.N.A Gel Extraction Kit 试剂盒，可是不知道为什么回收后电泳检测都没有条带，开始以为是洗脱液加的比较多，DNA浓度低，可是后来点样时加了18ul的量还是没有，检测时使用1%EB染色的胶。不知道哪里出问题了，都 做了好几次了，结果都是一样，其他大片段的回收后加5ul检测条带都很亮，就是这小片段回收总失败，求高人指点！！！！
可能是你用的试剂盒不好用吧，问其他人借别的公司的试试。 你的胶是什么做的，TAE 还是TBE？ 可能TBE不适合回收。 : Originally posted by zhaodahe at
可能是你用的试剂盒不好用吧，问其他人借别的公司的试试。 嘿嘿，不是哦，昨天终于给回收成功了，感觉是量不足，很稀的问题， : Originally posted by gniy at
你的胶是什么做的，TAE 还是TBE？ 可能TBE不适合回收。 TAE的，谢谢你哦，问题已解决:) 最后是什么具体原因造成的呢？ 回收小片段（&500bp）时，溶胶后加些异丙醇会好些。 应该是没切到目的条带 我和你说哦，这是很正常的，胶回收后经常是看不到条带的，因为回收效率低，我研究过，基本所有KIT都一样。但是即使看不到条带，它还是存在的，你就放心酶切，放心继续做。不信？你拿回收产物PCR试试，肯定能P出很亮很亮的条带！
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E-mail： & QQ：8835100单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题 - 分子生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题
最近做的几个克隆都非常不顺，一个多月了，天天连接转化涂板，天天收的空白板:(&&
一个涉及到多片段的连接：700bp+800bp+1.6kb+3.6kb
另一个是大片段单酶切连接（Pac I)：6.7kb+12kb
一直是怀疑连接的效率问题，单转质粒作为阳性对照确定感受态是好的。
具体：（1）多片段连接：确定多片段连接中的几个片段都是酶切彻底的，跑胶，切胶做回收，用的QIAGEN的胶回收试剂盒，但回收率一般，小片段（<1kb)回收后浓度仅达20ng/ul。回收后片段做连接，用的是NEB的T4 DNA ligase，他家的快速连接试剂盒也有试过，均按说明操作（普通连接酶：10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度；快速连接试剂盒：同上一样的体系，室温5分钟），均未有单菌落生长。
（2）大片段连接：6.7kb的insert质粒和12kb载体质粒均用PacI进行酶切，酶切后跑胶回收，载体片段回收效率很低，不到10ng/ul，insert片段也仅十几ng/ul，同样的用NEB的T4 DNA ligase做连接，10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度，未见有单克隆生长。
这段时间全耗在连接转化上面了，严重打击了我科研的信心:cry:
想求助一下大家在多片段的连接或大片段的连接转化中都需要注意哪方面的问题呢？有大牛帮忙分析分析失败的原因吗？
楼主的第一个克隆难度的确是蛮大的，第二个还好，
1. 根据你的描述，总是空板，你有没有测试过你转化时用的感受态的效率，因为你是多片段和大片段连接，对感受态效率还是有一定要求的，最好用那种超级感受态细胞转化比较好，因此，你首先测试下你的感受态细胞，同时用个阳性质粒测试你的平板的抗性，你天天收白板，也可能是你用错抗性平板了
2. 对于第一个多片段克隆，片段是不是太多了点，而且你是PCR产物直接酶切，你可以先把片段连上T-载体等中间载体，然后再酶切回收回来，这样保证每一个片段都被充分酶切开，然后再多片段连试试
3.对于第一个多片段连接，楼主是不是也可考虑用Overlap PCR的方法，先把四个片段拼接为一个片段再往载体上连
4. 你大片段连接的过程和体系都是没有问题的，但是你总是连接不上，会不会是所用连接酶有问题？
5. 不知道楼主大片段连接是，载体单酶切后有没有进行去磷酸化，如果没有的话，连接后，板子上应该会长很多克隆才对，这是载体自连导致的，是板子的问题还是感受态的问题，楼主可以排查一下 首先非常感谢gyesang的热心回帖！一早我就上来看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的问题，我一一做个排查：
1. 做过单转质粒的阳性对照，虽然没有每次都有这个阳性对照，但开始的时候是确定过抗性是对的，转质粒效率是没有太大问题的，至于是不是超级感受态我真不敢肯定，用的是全式金的Trans-T1；
2. 对于第一个多片段，四个片段均不是PCR后直接酶切，都是从质粒上酶切下来的...... 其中，前两个700bp左右的是insert，最初也是PCR酶切，但后来也是为了排除PCR酶切可能不完全，所以又先构到T载体中做了酶切回收，而后两个3.6+1.6kb的片段是载体片段中切下来的，所以能确定待连接的片段酶切是完全的；
3. overlap PCR的方法没做过，不知道是否可行，实现起来难度有多大？
4. 连接酶是NEB的T4，之前订的都被我用完了，所以最近做的这几次是用的新订的一支，可以考虑做个常规的连接排查一下连接酶的问题，先准备订个fermentas的连接酶试试；
5. 您这个问题真是问到我心里去了，这个问题也非常困扰我，载体单酶切后并没有做去磷酸化处理，为何连自连的都没有能？？板子和感受态都有空转质粒载体的对照，确定没问题。那么就是连接酶了。。。
另外，有推荐使用的超级感受态细胞吗？国外品牌的没法进口，但国内的不清楚哪家的感受态做得最好？以前都是做的常规克隆，所以也没遇到过这么多问题，请大家多交流指教了！ : Originally posted by serena08 at
首先非常感谢gyesang的热心回帖！一早我就上来看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的问题，我一一做个排查：
1. 做过单转质粒的阳性对照，虽然没有每次都有这个阳性对照，但开始的时候是确定过 ... 1. 关于你的第一个克隆，我强烈建议你先用Overlap PCR的方法把片段连好，再往载体上构建，从时间上， 比你在那撞运气式的四片段连接肯定会快很多，主要缺点就是需要合成引物，浪费钱，但为了实验，我们不在乎这点钱
2. 载体单酶切后并没有做去磷酸化处理，且没有自连，而且你的板子和感受态也验证没有问题，那你需要考虑换连接酶了，这里给你个推荐（绝对非广告，因为我们实验室一直用，就是觉的还可以），你可以去查查toyobo公司的ligation high这个连接酶
3. 关于感受态，我没有什么建议的，我们都是实验室自己做的感受态，专门人负责的，可能是经常做的缘故吧，都到了如火纯清的地步了，感受态基本没出现过问题，且好用，至于哪个公司卖，还真不清楚 不知楼主是否还在，我最近也在做一个多片段的连接问题，一直连不上，求指教！！！ 首先不做去磷酸化，就算连出来是你目标片段概率估计连1/1000都没有
之后你如果想提高浓度得话可以蒸发下你回收的DNA，或者用zymo的那种可以用6ul水洗脱的柱子
不过我觉得你应该是其他步骤有问题，10ng/ul的载体自连肯定能连出来。当然pacI我没用过，效率有点差别也有可能。另外12KB以上建议还是电转化，heatshock效率随着长度上升线性下降。 楼主后来怎么做的？为什么没有消息了？ : Originally posted by whs1230 at
楼主后来怎么做的？为什么没有消息了？ 楼主最后做出来了，我们私下交流的
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联系通知管理员，也可以通过QQ周知，我们的QQ号为：8835100
我们保证在1个工作日内给予处理和答复，谢谢您的监督。
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&&& 续前：大片段级：指的是片段大小超过10kb的DNA片断，由于越长的DNA分子和纯化膜的结合力越强，洗脱力越差，在离心过柱时可能被“扯断”，因此常规的离心过柱的方法并不适合对付这些大家伙。在凝胶电泳的大片断回收，特别是几十kb的大片断，经典方法是生物通前文提到的电洗脱。此外，低熔点琼脂糖和琼脂糖酶消化也是常常有人选用的方法，新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料，生物通在此一并介绍。其实无论用什么方法，在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片断，操作时一定要小心注意，粗暴的操作，最后结果也是自己来承受的。
&&& 这些方法中，速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟，谁愿意为一个小小的胶回收浪费2个多小时呢？有那功夫干点别的不好？我最早用的其实是当时的Pharmacia（后来改为Amersham，现在是GE Healthcare Life Sciences）的一个玻璃奶（Glassmilk）试剂盒。现在记得Glassmilk的人应该不多了，在当时却是我们眼中的神奇宝贝――半个多小时就可以完成本来要搞2个多小时的活：溶胶液溶胶后，加入10ul混匀的玻璃奶溶液，混匀静置吸附后，离心去上清，再清洗1―2次，干燥，最后用洗脱液洗脱，离心取上清即可。
1.QIAEX II
产地：Qiagen回收范围：40bp-50kb推荐指数：价格指数：（150次反应2,106，500包装4,860，约14元/反应，半价活动开始以来，这个试剂盒的性价比就很高啦）
通用性高：一般或者低熔点琼脂糖凝胶，TAE或TBE，以及聚丙烯酰胺凝胶
无NaI干扰后续实验
大片段DNA保存较好，不会被剪切
使用心得：
&&& 这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒，利用的是配合高离液盐（chaotropic salt）的silica-gel particles，因此QiaEX可以从盐，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，染料，蛋白以及核苷酸中无需苯酚抽提或者酒精沉淀即可获得纯化DNA片段。这个试剂盒使用方法和玻璃奶的试剂盒基本一样，区别在于玻璃奶是粉碎的玻璃，因此可能存在大小不一、边缘尖锐等情况，在离心力下，大小不同的碎片的沉降系数不同而导致在沉淀中分布位置不同，当长片断一头粘附在大片断一头吸附在小片断上，离心产生的剪切力就会导致长片断的断裂。而QiaEX的纯化填料是人工特制的大小均一的球形小珠（Beads），能更好的吸附DNA，也不易产生上述的剪切力问题，使得回收的大片断DNA更为完整。
&&& 无论是玻璃奶还是纯化填料，比起过柱的方法，优点在于适用于较大范围的DNA回收，从小片断到超级大片断都可以，适用范围广；而且每次反应可以根据估算的待回收DNA的量来放大或者缩小纯化试剂的量，比较灵活。比如QIAEX说是150反应（每次5ug），实际上往往可以用200多次或者更多。
&&& 但是这个方法的问题有2个，一个是比较麻烦，需要一定操作经验――无论是清洗或者是最后的洗脱，离心后要尽量多取上清而不干扰沉淀，多少有点点难度，特别是最后取洗脱的DNA，要舍得放弃最后那点上清，免得回收产物中混入了纯化介质，在后面的实验中得不偿失。所以，你可以从此想象，由于每次离心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的，去除始终不彻底，这就注定了这个方法纯化的产物纯度不如离心高，回收率也不如那么高。你看，QIAEX说这个回收产物可用于酶切、连接、标记和PCR，但是就没有提到显微注射芯片分析等更高要求的实验。另一个问题是干燥的程度如何把握需要一定经验――干过头了洗脱困难，没干透就会将酒精带入后继实验（有人向生物通投诉过纯化产物测OD得到非常奇怪的读数，过去一看操作，果然是没干透就洗脱的结果）――要干到沙面雪白而靠管壁的最边缘还有丁点透明就可以了。当然，这个现象描述起来不着边际，做过的人就心中了了。洗脱体积通常是20ul。操作要领除了前面提到的问题，就是离心充分，离心后取管子动作轻快，事前调好加样枪，取上清要轻，靠壁、放枪缓，动作利索，不要千万不要来回抽。舍得放弃。
QiaEX相关参数：
Binding capacity:
5 &g DNA per 10 &l QIAEX II suspension
60C95% of DNA fragments (40 bp C 50 kb)
Elution volume:
Elution volume: 20 &l
&&& 类似方法的产品还包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit
2 Agarose Gel DNA Extraction Kit产地：Roche-Applied Science回收范围：0.4kb―100kb(单核苷酸〉20bp）推荐指数：价格指数：（100次/1356，每次反应13元左右）
标准的或低熔点琼脂糖回收都可
可以用于克隆连接或者高特异性标记（基本标记或缺口平移primed labelling or nick translation）
0.4kb―9.5kb范围内回收率为80%
通用型试剂盒：大至100kbDNA片段到小到寡核苷酸都可以
均匀统一的纯化介质珠，减少剪切力，无杂质（比如酶抑制剂），不会影响后续反应
使用心得：
&&& Roche的胶回收试剂盒原理也是一样的，可以完成几乎实验室有关DNA胶回收的所有需要，从基因组大片段DNA到单核苷酸，并且在回收率上也有出彩的表现：0.4-9.5kb，大约80%；10-100kb，大约60%；单核苷酸（&20碱基），大约65%
&&& 其实，生物通前面提到的纯化介质的方法在使用中有一些操作的问题，其实改良起来也并不很困难。只要多提供一个单纯过滤离心柱，原来的问题看来应该不难解决――直接将混合有纯化介质的溶胶液加入柱子中过滤离心，吸附了DNA的纯化介质在膜上，上清彻底离心到管中，不就不用担心会悬浮沉淀、干沙等等问题了吗？其实Promega就有这样的解决方法，不过由于那试剂盒主要目的是纯化PCR产物或者酶切反应中的DNA，本身不带溶胶液，所以我们在这里就不具体介绍了。
&&& 这种方法通常需时半小时左右，算是比较快速省事的。毕竟大片断的操作要格外小心。除了这种方法，生物通在这里再重复介绍一下其他的一些方法。
&&& 1. 低熔点琼脂糖：如果你手头有Cambrex（原来的FMC，琼脂糖行业标准的制定者）的SeaPlaque GTG琼脂糖，那真是太幸福了。SeaPlaque是世界上第一个低熔点琼脂糖系列，Cambrex的GTG（遗传技术级别）级琼脂糖特别去除了抑制酶反应的各种杂质，可以在琼脂糖凝胶中进行各种酶切、连接、PCR、转化等等实验。所以，SeaPlaque GTG凝胶电泳后切下的条带就可以在65度融化（20-30度凝固），直接进行后继的酶切连接PCR等等的反应了，当然，前提是你的电泳槽和Buffer要足够干净，最好是专用的。这个反应条件实在是足够温和，当然不便宜，25克琼脂糖要1788大元!特别适合分辨200bp―25kb的片断。其实，也就是大小通用的方法。
&&& 如果只是普通的低熔点琼脂糖也不要紧，切下来的胶块加入缓冲液65度融化后冷却到室温，可以直接用等体积酚抽，也可以用琼脂糖酶来消化。酚抽时注意不要剧烈振荡以免损伤大片断DNA，两相间的白色物质是琼脂糖，取上清酚氯仿抽提后乙醇沉淀。琼脂糖酶可以消化融化的琼脂糖为低聚糖，随后用酚氯仿抽提后用乙醇沉淀。New England Biolabs的这种酶50单位价格300多，每200mg 1%凝胶用一个单位酶，42度条件下反应。Takara的这种酶100单位260多，同样体积的凝胶要用2个单位，可以在60度反应，所以也可以用常规琼脂糖。只是常规琼脂糖在65度挺难融，很费时间。
&&& 2. 电洗脱的原理是将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相，回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。电洗脱主要的麻烦是在透析带都比较大、两头要绑，没有刚性的袋子使用不方便，中间溶液体积大，膜面积大容易吸附产物。生物通在03年就有文章介绍以色列一家公司出品的GeBA产品，是在离心指管两边开窗贴上透析膜，这种管子可用于透析或者电洗脱，由于管子有刚性，内容体积固定，膜面积也很小，同时还提供电洗脱时放在电泳槽中的架子，操作起来十分方便，很大程度上解决了这个困扰。电洗脱条件温和，对琼脂糖没有特殊要求，同时还可以用于丙烯酰胺凝胶中的片断回收或者是蛋白质的回收。GeBA的产品基因有限公司有售，此外Merck旗下的Novagen也引进了类似的产品，价格相当。详细信息参考：。
&&& 3. 挖槽法。限于个人习惯的一些不入流的小技巧，有时应急（比如定的产品老不到货时）也可以对付一下。无非就是在条带前面挖坑，加入缓冲液，继续电泳半分钟，手提紫外观察，等条带全“下海”就把坑里的溶液都吸上来。大片断会遇到的问题通常是出胶慢，上对岸倒快，所以应对就要用2手，一个是在坑里缓冲液中加点什么让泳动速度降下来（低熔点琼脂糖就是其中一个方法），要不就在对岸堵上孔径特小的膜，等这边条带全部下水后反向电泳一下，让被膜阻挡的DNA回头，离开那膜。然后取溶液纯化DNA。这些方法通常在条带浓，回收率要求不高的时候可以应急，挺磨耐性的，平常还是用Kit的算了。这里提到的老方法，都要特别注意，切胶的刀要干净锋利，切口平滑，切得不整齐有时DNA出胶很慢，不知道为什么。我们这里写写，算是忆苦思甜好了。（转下页）&&?&
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切胶回收SDS-PAGE片段
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秀基因 个 秀蛋白 个
我想从SDS-PAGE中切胶回收我需要的蛋白条带，谁有具体的过程吗？非常感谢
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秀基因 个 秀蛋白 个
蛋白胶回收步骤：
（1）制作浓缩胶时，不插梳子（浓缩胶高度适当降低），或只插只有两个泳道的，一个小泳道点蛋白marker（预染，有颜色的），另外大的全部点目的蛋白样品。
（2）待跑完电泳后，除去浓缩胶，用高浓度的金属盐浸泡胶（本人只用过饱和硫酸铜。SDS和金属离子可以形成沉淀）。15s内，胶即可分为白色和无色部分（会有蓝色本底），将无色部分切下，这个为目的切目的条带，尽量将无关的剔除干净
（3）用EDTA盐浸泡清洗，除去金属离子，直至胶变为无色。
（4）用dd water清洗胶；
（5）用20%乙醇清洗；
液氮研磨即可直接用来免疫。
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Mashinokia
& & 非常感谢你的回答！呵呵！
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Mashinokia
& & 有个细节想请教你哈！就是用EDTA浸泡的时候，EDTA的浓度时多少啊？还有， 你觉得这个过程中，最关键的有哪些？十分感谢！！
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Mashinokia
& & 不是切无色的下来么？为什么用EDTA清洗为无色？
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秀基因 个 秀蛋白 个
好东西！ 支持
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秀基因 个 秀蛋白 个
上海生工有，联系电话021-
PAGE胶蛋白微量回收试剂盒& &&&
Micro Protein PAGE Recovery Kit & & & &
产品说明：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）不仅可用于检测蛋白质的相对分子质量，而且也是分离纯化蛋白质的重要工具之一，随着蛋白质技术的微量化，有必要从凝胶中回收蛋白质以用于制备抗体、免疫印迹、氨基酸组分分析或末端序列测定等，本产品就是专门为此用途开发的微量蛋白胶回收法,本产品适用于从考染（SK3011），铜染（BSP017）或锌染（BSP019）中回收蛋白质，回收效率在50-80%,能够使用20次。Store: 2～8℃
1. 简单，不需要复杂而昂贵的仪器（如电洗脱仪）;
2. 适用于变性胶（SDS-PAGE）和非变性胶;
3. 回收率一般在50-80%之间（跟蛋白质大小，洗脱时间相关）;
4. 跟后续的实验兼容，包括2-D电泳、质谱测序等。
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秀基因 个 秀蛋白 个
您好，你做出来没有？我也想这样做，效果怎么样？
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秀基因 个 秀蛋白 个
在这看到您的帖子，您说的切完的胶液氮处理研磨即可免疫是怎么个过程？胶会碾的很碎么？直接混佐剂，不会堵针头吗？期待您的回复。
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秀基因 个 秀蛋白 个
多加些无菌水、佐剂，不会堵孔的。我试过好几次，免疫Bal b/c小鼠的。
还有，EDTA是用来螯合除去金属离子的。