亲权指数多少是亲子5.94e-184存在亲子关系吗

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基于叶绿体 DNA PCR-RFLP分析的部分柿属植物间 的亲缘关系 1

胡德昌,张青林,罗正荣

华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室,武汉(430070)

)基因型间未检测到变异位 点。应用 NTSYS 中主坐标分析和 PHYLIP 中 Wagner 简约法分析结果显示,柿与君迁子和 浙江柿的亲缘关系较近, 而与美洲柿和老鸦柿相距甚远。 金枣柿与供试中国原产柿属植物表 现出不同的 cp DNA扩增谱带限制性内切酶酶切位点,推断其可能是柿属植物的一新种。 关键词:柿属植物,叶绿体 DNA , PCR-RFLP ,系统发育

Yonemori 等(1998)对原产东南亚部分柿属植物 包括 24个种的两个叶绿体区域,共 25个引物 /限制性内切酶组合分析种间亲缘关系,推断 柿与君迁子、美洲柿亲缘关系较近。 Ino 等(2002)根据柿属植物 ITS 和 mat K 序列变异进 行系统发育分析认为非洲各种与柿亲缘关系较远。 此外, Choi 等 (2003, a; b) 应用 rDNA 5S和 45S 染色体原位杂交技术发现部分柿属植物包括非洲 4个种与亚洲 7个种显著不同。 高等植物叶绿体基因组一般为母系遗传, 相对于核基因组结构和序列非常保守, 所以叶 绿体基因组被认为是研究种间甚至种内材料系统进化和亲缘关系的理想工具(Palmer, 1987; Randall 等 , 1998)。目前, cpDNA 序列比较和酶切特异扩增片段已经广泛应用于植物种类 分析,以期为研究柿属植物亲缘关系以及栽培柿的起源提供进一步的证据。 1. 材料与方法

试材为柿属植物 7种共 29个基因型,全部采自华中农业大学柿圃。其中 ‘ 金枣柿 ’ 的分 类地位尚不清楚。

1本课题得到国家自然科学基金()的资助。

1.3 PCR扩增和限制性酶切

。扩增产物通过溴化乙锭(EB )染色的 2%琼脂糖 凝胶电泳检测。 SYNGENE 凝胶成像系统观察并记录谱带。

染色的 2%琼脂糖凝胶电泳检测。 SYNGENE 凝胶成像系统观察并记录谱带。

Wagner简约法构建系统树,并进行 1000次自展检验计算自展值。

表 2 cpDNA通用引物序列及扩增条件

利用 10对 cpDNA 通用引物均能在供试 29份柿属植物中扩增出一条谱带,通过 2%琼 脂糖凝胶电泳分别检测到其同一个位点的扩增产物间无明显长度差异, 表明柿属植物叶绿体 基因组序列十分保守。本实验共扩增柿属植物叶绿体基因组 20.4kb DNA片段 , 约占其叶绿 体基因组的 12.6%。

1.B 480bp, 280bp 附近 的酶切片段呈现长度多态性,表明 cpDNA 序列存在小片段的插入和 /或缺失。在图 1B. 中, 美洲柿 800bp 左右谱带密度相对较大,可能是两条 800bp 左右片段的重合。

在 trn C -trn D 区域, 4个引物检测到多态性,能明确将 7个种分为 6组:老鸦柿;美洲 柿; 金枣柿; 油柿; 君迁子和浙江柿; 柿。 在 29个多态性引物 /内切酶组合中, 仅 trn H-trn K/RsaI, rbc L/AluI两个组合检测到浙江柿与君迁子的位点变异,表明两者序列同源性高。图 1.C 表 明金枣柿与供试中国原产柿属植物表现出明显不同的 cpDNA 限制性内切酶酶切位点。老鸦 柿和美洲柿扩增产物酶切电泳图谱与其他柿属植物均有显著差异, 表明两者的叶绿体基因组 序列存在较丰富的变异(图 1.D ) 。

柿种内基因型的叶绿体基因组的酶切位点变异极少,仅在 trn S-trnf M/RsaI引物 /内切酶 组合检测到雄株 9号的特异谱带类型(表 3) 。在所检测的 trn H-trn K 等 10个叶绿体基因间 隔区域,未发现罗田甜柿、鄂柿 1号等中国原产甜柿种质与分布于中国台湾、日本、韩国和 美国的部分柿品种之间酶切位点变异。完全涩柿(磨盘柿等)、不完全涩柿(平核无)、不 完全甜柿(禅寺丸等)和完全甜柿(罗田甜柿、富有等)等脱涩性状不同的 22个柿品种间 未检测明显差异; 9倍体的 ‘ 平核无 ’ 与其它 6倍体的柿品种酶切类型相同。说明起源、染色 体倍性和果实脱涩性状不同的柿基因型间其 cp DNA 序列十分保守。

图 1 部分柿属植物叶绿体 DNA 通用引物 PCR 特异扩增产物经过限制性内切酶酶切后 2%琼脂糖凝胶

根据所得到的酶切位点变异数据,利用 PHYLIP 3.62 Wagner简约法分析构建柿属植物 7个种无根系统发育树(图 2)。在图 2中, 6倍体栽培柿与多倍体的老鸦柿和美洲柿处于 树状图不同的分支上, 表明柿与老鸦柿、 美洲柿亲缘关系较远, 而与原产中国 2倍体君迁子 和浙江柿亲缘关系相对较近。尽管柿与美洲柿具有相同的倍性,但 cpDNA 序列变异表明两 者具有不同的祖先,与

应用 NTSYS2.10e 程序进行主坐标分析,得到柿及其 6个近缘种的散点图(图 3) 。结 果表明,柿属植物 7个种完全分开,柿与老鸦柿、美洲柿分布位置距离最远,表明柿与老鸦 柿、美洲柿进化关系较远,而与 4个 2倍体种,君迁子,浙江柿,油柿和金枣柿亲缘关系相 对较近, 与无根系统发育树结果一致。 Wagner 简约法得到的无根树 (图 2) 和主坐标分析散 点图(图 3)均表明浙江柿与君迁子亲缘关系非常近。金枣柿为 2倍体(杨勇等 , 1999),

图 3表明与相同倍性的君迁子和浙江柿亲缘关系较近,但单独成组。

图 2 基于叶绿体基因组非编码区域 PCR-RFLP 变异位点和 PHYLIP 3.62 wagner简约法构建的柿属植物无根 系统发育树。分枝旁数值为 1000次自展检验所获得自展值。

序列重复位点检测到多倍体柿属植物美洲柿和柿序列同源性低, 推断两者具有不同起源。 Guo 等(2006, a;b)应用 SRAP , IRAP 和 REMAP 分子标记进行 UPGMA 聚类分析均表明美洲柿与柿亲缘关系较远。 Hu 等(2006)检测柿属植物 7个种线 粒体 DNA 多态性并进行聚类分析,同样认为美洲柿与柿亲缘关系相对较远。

萄 160,928bp (Jansen 等 , 2006),估计柿叶绿体基因组全长为 161,000bp 。本实验共检测柿 cpDNA 20.4kb,约为 12.6%,并应用 90个引物和内切酶组合检测到柿及其近缘种产生显著 不同的酶切电泳谱带类型。 根据胞质基因组的母系遗传规律排除了老鸦柿和美洲柿为柿起源 母本的可能性。尽管柿、老鸦柿和美洲柿均为多倍体,但根据 cpDNA 变异位点进行的系统 发育分析结果表明三者之间具有不同的祖先,此观点不支持 Yonemori (1998)柿与美洲柿 具有共同起源的推论。

金枣柿染色体数 2n =2X=30,主产于中国浙江省松阳、缙云等地,落叶乔木,形态特征 与柿品种有诸多不同之处,如叶面极富光泽 , 叶片正反两面均光滑无毛 , 叶脉极为明显 ; 枝 条棕黑色 , 光滑无皮孔(杨勇等, 1999)。 Guo 等(2006, a;b)应用 SRAP , IRAP 和 REMAP 分子标记技术对金枣柿与其它柿属植物间的遗传关系分析以及 Hu 等(2006)应用 mtDNA 通 用引物扩增结果均表明金枣柿单独成组。本文结果认为金枣柿应是柿属植物中的一个新种。

表 3 23个柿品种及其 6个近缘种 10个 cpDNA 扩增区域酶切位点的存在(+)或缺失(-)

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