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实验基本操作解读.ppt 57页
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2014年丹东耘垦饲料有限公司品控部专业技能培训 实验操作技能培训 玻璃仪器的使用及分析实验的注意事项 主要使用仪器： 酸式滴定管 碱式滴定管 容量瓶 移液管 量杯 量筒 洗耳球 电子天平等。 一、玻璃仪器的洗涤 1．用水刷洗：
此法既可洗去溶于水的物质，又可使附着在仪器上的尘土和不溶性物质脱落下来，但对油污效果并不好。洗刷时，且要选用合适的刷子，如用试管刷去洗烧杯，就不合适。因为试管刷太细，不易将烧杯底洗净。若刷子顶端无毛，则不宜使用，易损坏玻璃器皿。
一、玻璃仪器的洗涤 2．选择合适的洗涤剂：
在一般情况下，可选用市售的合成洗涤剂，对玻璃仪器进行清洗。当仪器内壁附有难溶物质，用合成洗涤剂无法清洗干净时，应根据附着物的性质，选用合适的洗涤剂。如附着物为碱性物质，可选用稀盐酸或稀硫酸，使附着物发生反应而溶解；如附着物为酸性物质，可选用氢氧化钠溶液，使附着物发生反应而溶解；若附着物为不易溶于酸或碱的物质，但易溶于某些有机溶剂，则选用这类有机溶剂作洗涤剂，使附着物溶解。此外还有还原性洗涤液，如粗盐酸、草酸、亚硫酸钠、酸性硫酸亚铁等洗涤液。主要用于洗一些不溶性的固体氧化剂如MnO2等。 一、玻璃仪器的洗涤 试举几例：
久盛石灰水的容器内壁有白色附着物，选用稀盐酸作洗涤剂；盛放碘的容器底部附结了紫黑色的碘，用碘化钾溶液或酒精浸洗；久盛高锰酸钾溶液的容器壁上有黑褐色附着物，可选用浓盐酸作洗涤剂；仪器的内壁附有银镜，选用硝酸作洗涤剂；仪器的内壁沾有油垢，选用热的纯碱溶液进行清洗。
3．实验室配制的洗涤液：
（1）浓硫酸——重铬酸钾洗涤液（又称铬酸洗涤液）：这种洗液具有很强的氧化性，对有机物和油污的去污能力特别强。适宜于一些对洁净程度要求较高的定量器皿（如滴定管、容量瓶、移液管……等等），以及一些形状特殊、不能用刷子刷洗的仪器。
浓硫酸——重铬酸钾洗涤液具体配制方法：
称取10g研细的重铬酸钾固体，加热溶于20ml水中，待冷后，边搅拌边缓慢地加入180ml浓H2SO4（切勿将溶液加入浓H2SO4！），冷后，移入磨口瓶中保存。　 使用洗液的方法及注意点如下：
①使用洗液前，应先用水刷去外层污物，并用水冲内层污物。冲洗完毕后应尽量将仪器内的残存水倒掉，避免水把洗液冲稀，降低其氧化能力。
②用洗液时，首先将洗液倒入仪器中1/5至1/4的容积，然后慢慢地将仪器倾斜旋转，使仪器的内壁全部为洗液润湿，反复操作一、二次；然后将洗液倒回贮存瓶中，倒置一会儿，让残存的洗液流尽，然后用水将附着在内壁的洗液冲洗干净；最后用少量蒸馏水或去离子水洗去残存在自来水中的Ca2＋，Mg2＋，Cl－等离子，反复此操作三次左右。若仪器较脏，可将洗液充满整个仪器，浸泡一段时间，或用热洗液洗，去污能力更强。
使用洗液的方法及注意点如下：
③洗液可重复使用，直至洗液变绿色（重铬酸根被还原成Cr3＋之故），才失效报废。 ④洗液变稀时，将会有重铬酸钾析出，氧化能力将有所将低，但仍可使用。也可将其蒸浓后再用。洗液具有很强的腐蚀性，会灼伤皮肤和破坏衣物。如不慎把洗液洒在衣物上，应立即用冲洗；若洒在桌上，应立即用抹布揩去，抹布用水洗净。 ⑤Cr(VI)有毒，清洗残留在仪器上的洗液时，第一、二遍水不要倒入下水道，应倒入废液缸中统一处理，以免污染环境。
（2）氢氧化钠——高锰酸钾洗涤液：此类洗液适宜用于洗油腻及有机物较多的仪器。 此液的配制方法：称取4g高锰酸钾溶于少量水中，缓慢地加入100ml 10% NaOH溶液即成。此类洗液腐蚀玻璃，不宜洗定量精密仪器，且洗后会有二氧化锰沉淀，可用浓盐酸或亚硫酸钠溶液洗去。 4．洗涤玻璃仪器的操作方法 对附有易去除物质的简单仪器，如试管。烧杯等，用试管刷蘸取合成洗涤剂刷洗。在转动或上下移动试管刷时，须用力适当，避免损坏仪器及划伤皮肤。然后用自来水冲洗。当倒置仪器，器壁形成一层均匀的水膜，无成滴水珠，也不成股流下时，即已洗净。一些构造比较精细、复杂的玻璃仪器，无法用毛刷刷洗，如容量瓶、移液管等，可以用洗涤液浸洗。
4．洗涤玻璃仪器的操作方法 （1）滴定管：洗涤前先检查活塞上的橡皮盘是否扣牢，防止洗涤时滑落破损；注意有无漏水或堵塞现象，若有则予以调整。滴定管的洗涤须依次用铬酸洗液、自来水、蒸馏水和操作溶液洗涤。关闭活塞，向滴定管中注入洗涤液2～3毫升，慢慢倾斜滴定管至水平，缓慢转动滴定管，使内壁全部为洗涤液所浸到。竖起滴定管，再旋开活塞，放出洗涤液，这样使活塞的入段也能洗到。洗液放出后，先用自来水冲干净，再用蒸馏水洗三次，每次10～15ml，
4．洗涤玻璃仪器的操作方法 用蒸馏水洗涤后，洗净的滴定管其内壁应完全被水均匀地润湿而不挂水珠，然后用待装入的操作溶液（即标准溶液或被标定的溶液）洗涤三次，每次约5～
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[公告]有奖活动～征集实验动物技术操作标准操作规程(SOP)&[精华]
页码直达：
这个帖子发布于11年零251天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
一、征集内容如下：
动物实验室管理：大、小动物实验室管理规范、标准操作规程。动物试验人员管理、受试管理实验技术：涉及动物实验等内容，包括动物实验资料、实验数据的管理操作规程等。实验中的技术、进展、应用的操作规程。仪器： 动物用仪器使用操作规程，仪器检修或者调试保养操作规程
二、征集格式如下：
原创（或者转载，转载请注明转载地址或者连接）名称：_________ 标准操作规程(SOP)关键词：必填项目目的：必填项目背景知识：选填项目原理：选填项目主体内容：操作步骤，必填项目 主要参考文献：选填项目：
三、加分规则：
本活动作为版块的积分奖励活动。1、凡填满必填项内容并经确认无误的加1～2分鼓励！2、比较有重大参考价值的原创作品再加1分鼓励！3、不大于3分/月/id。 所有积分奖励活动接受广大站友和版主的监督。
四、注意事项：
1、所录入的sop必须注明是转载或者原创2、对于参考价值很小的、或者sop经过考察不可行的不予加分！
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leancao 编辑于
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原创名称：实验动物寄生虫监测标准操作规程(SOP)关键词：实验动物寄生虫监测目的：规范实验动物寄生虫监测的具体过程，确保监测结果可靠。主体内容：实验动物的寄生虫种类繁多。从寄生虫分类学角度，可分为原虫、蠕虫及节肢动物，蠕虫又可分为吸虫、绦虫和线虫。从宿主角度，可分为小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、猫、犬及灵长类的寄生虫。从寄生部位，又可将寄生虫分为体内寄生虫与体外寄生虫。1. 体外寄生虫检查方法（1）观察法：用肉眼观察或借助于放大镜对动物进行仔细观察，体外寄生虫感染严重时，可引起动物脱毛、毛糙甚至由于瘙痒引起溃疡、结痂，检查时尤其注意动物易感染部位，如耳根、颈后、眼周、背部、臀部及腹股沟等。用梳子梳理动物毛发，可发现虱、蚤等节肢类寄生虫。（2）透明胶带粘取法：适用于大、小鼠，将2cm宽的透明胶带剪成与载玻片近等长的胶条，粘取动物毛发，查螨。（3）被毛检查法：取宿主易感染部位被毛少许，加一滴生理盐水后加盖玻片，镜下观察有无虫体。（4）皮屑刮取法：用刀片刮取宿主感染部位，尤其是出现溃疡或结痂处，用力刮取深层屑片，置于载玻片上，加两滴10％ NaOH溶液使之液化（或两滴甘油使之透明），加盖玻片镜检。此法适用于疥螨和痒螨的检查。2. 体内寄生虫（1）肠道寄生虫：采取粪便，用肉眼观察有无可见线虫、吸虫或绦虫的节片，然后将粪便直接涂片检查虫卵、包囊及原虫。也可采用以下方法检查：①饱和盐水漂浮法：在有粪便标本的漂浮管内加少许饱和盐水，调匀，再加饱和盐水至漂浮管3/4处，放置3～5 min，挑去粗渣后，加饱和盐水至液面高出管口，静置20 min，用盖玻片轻轻压于液面，垂直提起，放在载玻片上镜检。②离心沉淀法：将标本加入离心管内，以1500 rpm 离心15 min，弃去上清液，将剩余少许液体与沉淀混匀，用吸管吸出滴在载玻片上，加盖玻片镜检。③解剖动物：解剖动物，从肠道收集标本。（2）组织内寄生虫：在解剖动物时，对疑为寄生虫感染的部位做组织压片、切片检查。血液寄生虫
实验动物的血液寄生虫极为罕见，从野外捕获或有野外媒介昆虫侵入的饲养环境中的动物不排除血液寄生虫的感染。检查时，取末梢血、静脉血或骨髓制成涂片，染色后镜检。此外，用于微生物学检查的多种免疫学方法均可检查寄生虫。
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名称：大鼠灌注取脑 标准操作规程(SOP)关键词：大鼠
灌注取脑目的： 完整取出大鼠脑部（取材）操作步骤流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.1 多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。我们用的方法：加热至60～65℃固然融解的快，不过容易挥发，气味难闻，不是好的选者。我们是这样做的，感觉不错，在此强烈推荐：先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37c水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。 3 麻醉后开胸：暴露充分些容易心脏穿刺及剪开右心耳。箭头所指为右心耳。 4心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血。 5 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。6 先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。 7 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。 8 分离除去后颈部肌肉 。9 用弯钳仔细剔除颅骨 。
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名称：转基因小鼠模型的建立(SOP)关键词：转基因小鼠目的：在动物体研究转化基因背景知识：无原理：
转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。当制备转基因动物时，外源基因可能只整合到动物的部分组织细胞的基因组，也可能整合进动物所有组织细胞的基因组中。部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物。此类动物中，只有外源基因整合的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，转基因才具有遗传性状，否则，外源基因将不能传给子代。转基因的方法多样，有胚胎干细胞法、逆转录病毒载体法，显微注射法等，此章介绍显微注射法制备转基因小鼠。此法获得转基因动物的数量较多。（一）显微注射法的基本原理和方法转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射法注入供体小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞)，然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，通过分析转基因和实验小鼠表型的关系，研究揭示外源基因的功能，而且可进行工程动物的大量生产。Gorden等报道了显微注射法用于转基因小鼠的制备。本法是最早，且应用成功率较高的一种转基因方法。其基本步骤如下：1．同步获得供体雌鼠（注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得）和假孕受体母鼠（正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生)。2．供体鼠注射绒毛膜促性腺激素后，采集清晰的原核受精卵。
3. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。4. 受精卵鉴定 ，将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管(或子宫)内，饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。 5. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。6. 转基因小鼠品系的建立。
[优点]（1）外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高；（2）此法导入外源基因无需载体；（3）转基因小鼠得率在60%-80%；（4）导入的外源基因可长达50kb。[不足之处]（1）外源基因随机整合；（2）个别原核不清晰，需进行特殊处理；（3）需大型精密仪器，费用昂贵；（4）操作周期相对较长。
（二）实验器材的准备1．输精管切除术用器材：弯式有齿镊、直式有齿镊、显微镊、手术剪、自动小夹涂药器、自动小夹、带弯针4/0丝线及持针器、直径为10cm塑料 Petri氏培养皿（内盛70%乙醇）。2．手术前麻醉
2，2，2 三溴乙醇（阿佛丁）是相当有效的麻醉剂。因该试剂对光敏感，所以应该于4度避光保存，新试剂用前应进行测试。经腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后，为了使麻醉剂尽快发生作用，将小鼠放回原笼熟悉的环境中，小鼠将会更容易松驰下来。 挤压小鼠脚垫，如果小鼠能感觉到此刺激，小鼠将从挤压部位开始缩腿运动（pedal reflex），用此方法可以检察是否麻醉完全。实验中小鼠无缩腿运动、小鼠达到手术所需的麻醉深度以及程度方可开始手术。
三溴乙醇的反复使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎症反应。其他麻醉剂中，克他命/甲苯噻嗪在兽医界广泛应用，另外，克他命/美托咪定也越来越受到青睐，特别是在美国。我国一些实验室用戊巴比妥钠的效果好,特别是尾静脉注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊巴比妥钠0.3ml左右。3．受精卵的采集用器材：70%乙醇、手术剪、10mL解剖剪、手术镊、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等。4．离体输卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科镊子、5号镊子、无菌30-mm组织培养皿、解剖显微镜、透明质酸酶、移液管、工作液、M16溶液（Sigma）、3ml注射器等。5．DNA显微注射用器材（1） 受精卵的收集与移动用器材：巴氏移液管、酒精灯、特制吸管、玻璃刀等。（2） 凹玻片准备：一块标准的凹型载玻片（硅化）、矿物油（Sigma）、工作液等。（3） 注射设备的设置：微型水力驱动设备、Hamilton Gas-Tite™注射器（250 l）、Intramedic™管道系统（外径1.27mm，内径0.86mm）、两只玻璃管道连接头、三通管连接器、一只带接头的60ml塑料注射器、一只器械套管、矿物油等。（4）受精卵的显微注射用器材：凹玻片（显微注射用）、倒置立体相差显微镜或倒置Nomarski立体光学显微镜、显微操纵器、千分尺（连接添满矿物油，且耐气构造的250l汉密尔顿注射器）、气压装置(50ml充满气体的注射器) 、持卵管、预载DNA的注射针等。6．输卵管转移的准备（1） 手术试剂器材：麻醉剂（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇、一副钝性齿镊、两副5号精细镊子、一副10cm手术剪、带自动小夹的金属大剪、一个小弹簧夹、外科缝线、解剖显微镜、纤维光学照明器、载针头的1ml注射器、kimwipe绵纸或外科纱布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手动移卵管等。所有的手术器械在使用前应该彻底清洗，70%乙醇消毒或高热灭菌处理。（2）受体母鼠的准备
输卵管转移的受体鼠应该为4-6周龄大小，体重在20-25克左右，严禁用低体重以及超重母鼠，若体重较低，其体能不足以维持妊娠，可能导致受精卵的重新吸收；若体重较重，麻醉剂被吸收入脂肪组织，降低麻醉效果，可能使手术困难，而且脂肪组织的存在意味着静脉的存在，所以手术时切掉脂肪组织可能导致不必要的出血，难以确认手术时的操作对象。出血也可能堵塞移卵管。选择输卵管转移前一天晚上与切除输精管小鼠交配的假孕母鼠，注射当天早上母鼠可见精栓。尽管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，随着体重的增加，它们将表现出不同程度的感觉消失，但它们是优良的哺育母鼠。另外，它们的价格也便宜。另一个成功的鼠系是B6D2F1，它们生命力强并有一定杂合优势。（3）麻醉剂：阿佛丁被证明是输卵管转移手术的有效麻醉剂。（三）实验操作程序和方法1．鼠系克隆（1） 动情期的探测：在转基因动物模型的建立中母鼠动情期的监测有很高的技巧性。小鼠的动情期主要划分为四个时期：① 动情后期：阴道口无扩张，周围组织为灰白色，阴道口周围无膨大② 间情期：阴道开口小，周围组织为灰色或蓝色。③ 动情前期：阴道口逐渐扩张，阴道周围组织由粉红色变为红色。④ 动情期：阴道周围组织颜色由红色转为粉红色，阴道口背侧唇可见条纹，阴道口腹侧唇可见肿大，阴道有分泌液外渗。
随机选择动物，任何时间都可能有20%-25%的动物处于动情期。大多鼠科动物的动情期平均持续4-5天，所以对群居性动物的个体进行动情周期的同步化处理后可能在任一时期产生大量发情动物。动情期动物的选择需两个指标：阴道周围组织色泽和组织膨胀的程度。动情期动物阴道组织深粉红色，但并不同于炎症时的色泽。另外，阴道口周围背腹部组织肿胀而有光泽，起初其腹部可见条纹。个别阴道口组织色泽较深，但无膨胀，或阴道口稍微扩大且略带灰色者为非动情期动物，切勿误选它们用于交配。（2）交配的确认：阴栓形成。动物合笼后，确定雄性个体是否与母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在阴道内凝固成柔软栓性物，成功交配后不久有阴道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根处，使小鼠头部向下，仔细观察阴道口部位，交配过的雌性小鼠可见有白色橡皮擦状的阴道栓，易肉眼所见，难以确定时可用小探针检查阴道深部是否有栓子存在。检查阴栓应在每天早上的早些时间，因为随着时间的推移，阴栓将被排出体外。2．输精管切除术：输精管切除小鼠用于与晶胚转移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周龄进行输精管切除术，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的实验对象。阿佛丁腹腔注射麻醉剂量为240mg/kg。 （1）&&称重后麻醉小鼠，背位固定小鼠，大剪刀贴近皮肤剪毛，70%的乙醇涂
搽消毒手术切口部位，以防止毛发污染切口。（2）&&于生殖器前方大约1.3cm处横行剪开下腹部皮肤，作约1cm的切口， 用浸70%乙醇的纱布搽拭切口部位以清理毛发。（3）&&切开腹膜，进行膀胱定位。每侧都可见有一条管道走行，用镊子轻轻夹持左侧管道，提起部分使手术视野清晰可见，确定其为输精管。（4）&&将镊子插进输精管下方，使它们处于自然状态，其末端垂直。同时在该位置两端用缝线结扎输精管，距离大约4-5毫米。在两结扎点间剪断输精管，置其于纱布上确定此侧手术完毕。 （5）&&将输精管两个断端轻轻放回腹腔，如上处理右侧输精管。两侧手术完毕后，2-3根单独缝线缝合腹壁切口。待用缝线须浸泡在70%乙醇中，保持缝线湿润，防止结扎时粘附组织。用两个或三个自动小夹夹闭皮肤。（6）&&为保暖包裹小鼠于纱布中或将其放置于热垫内使其苏醒，处于麻醉状态下的小鼠应该严格监护直到其完全苏醒。手术后小鼠饲养2周后确定手术是否成功。（7） 实验性饲养：将1-2只母鼠与输精管切除小鼠合笼饲养，次晨进行阴道栓检查。有阴道栓的母鼠，用磷酸缓冲液处理后24小时，其输卵管潮红。卵细胞应该处于单细胞期或未受孕状态，若处于双细胞期，则输精管切除未完全，雄性小鼠应进行再筛选。3．受精卵的收集（1）受精卵的采集：受精卵获得的方法分自然排卵和激素诱发排卵以及体外受精三种方法。本章对诱发排卵法给予介绍。
诱发排卵法：雌性小鼠生后6—8周达到性成熟，性周期均为4—5 日，其排卵时间可用饲养室的明亮和黑暗进行调节，所以必须对饲养室的明暗规律进行准确严格地管理。
性周期是卵泡刺激素和黄体生成素相互作用的结果，我们可以从外部给予这些激素诱发排卵。向成熟雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)之后，约在48—54h后再将2.5-5.0 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔内，约12h后即可诱发排卵。排卵数量可达自然排卵的2倍，效果很好。雌小鼠给予hCG后应立刻与雄性合笼。成熟雄小鼠应按每笼饲养1只，雄性小鼠大小在12周龄到1年。合笼时，须将激素化雌性小鼠放进雄小鼠的笼中。雄小鼠释放促雌性发情的外激素，在交配过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。显微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前几小时收集，此时易进行注射操作。交配后过夜小鼠的阴道栓易见，可用交配指示剂指示。对超排卵的交配母鼠体内进行阴道栓计数一般正常。低比率的有栓母鼠说明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配过度或雄性小鼠老龄化。收获受精卵必须打开小鼠腹腔，输卵管必须仔细切开。输卵管冲洗术或输卵管壶部切开术都可作为收集受精卵的方法。（2）腹腔内输卵管的切开1） 通过断颈或二氧化碳吸入快速处死小鼠。 2） 将动物背位固定在无菌干燥的吸水纸上，剪毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。以避免毛发污染手术视野。
3） 持眼科镊捏紧下腹部正中线皮肤，用外科剪作小的横切口，剪刀钝性分离充分暴露手术视野，或钝性撕开皮肤暴露腹膜。用眼科剪打开腹膜，充分暴露腹腔与子宫角部手术视野。子宫为Y形，为起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支为两侧子宫角，向上横行深入腹腔。 4） 用镊子距输卵管卵巢6-7mm处夹持子宫角翻转后轻轻拖出腹腔，在镊子捏点下部子宫角下方附近刺破肠系膜，清除肠系膜组织远离子宫角与输卵管，并防止用力过大压破子宫角与输卵管连接处。5） 用镊子拖出脂肪垫，卵巢，输卵管以及子宫部件。小心剪掉卵巢与输卵管之间的薄层膜，然后剪下输卵管和部分子宫角，将其盛放在盛工作液的小玻璃皿中，对另一侧输卵管重复上面操作，完毕后如上处理下一只动物。（3）离体输卵管内受精卵的收集：解剖镜下观察近输卵管漏斗部上部明显潮红此为壶腹部。用眼科镊子撕开膨大的壶腹部即看到包绕受精卵的丘细胞团。1）转移输卵管于含工作液的小玻璃皿中。2）眼科镊子夹持壶腹部，并用另一只眼科镊子撕开膨大的输卵管，游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤压输卵管将受精卵推出裂口。（4）透明质酸酶处理与受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成团状，微注射用的受精卵必须是单个细胞，而且无细胞碎片。漂洗细胞时，首先用工作液除去细胞碎片。不成团细胞可用无菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中，注意把握移液管的张力。溶解在工作液中的透明质酸酶对细胞团以及复合体进行消化时必须严密观察，一旦细胞团溶解立即将单细胞转移到新鲜工作液中，防止消化过度。用工作液漂洗2-3次，清除碎片后，用无菌移液管将受精卵置于特殊培养基（M16），放于37C, 5% CO2孵箱中待注射，此培养基上层覆盖高压消毒矿物油，可防止污染同时防止培养基水分蒸发影响pH。受精卵在体外发育较体内快，在孵育过程中注意观察一些受精卵清晰可见原核形成，在此期间可先选出原核清晰的卵(形态稍不规则)用于注射，其它卵继续培养。注射后，再筛选，再注射，直至得到满意的注射卵数。4．显微注射（1）导入DNA的制备：显微注射首先涉及导入DNA的制备，显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA，转基因所用载体是真核表达载体，即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠，必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA，对导入基因的大小没有特别的限制，长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针，如琼脂糖颗粒、纤维物质等，需尽量超速离心除去。DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml，当DNA注射浓度超过一定上限时，实验效果不佳，而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。导入DNA的制备程序如下：1）&&通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。2）&&为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏，用长波紫外光显影。3）&&切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。4）&&乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。5）&&-200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。6）&&用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。7）&&按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。8）&&注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制9）&&通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度10）&&用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/l.（2） 器械准备[注射针的制作] 注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。[持卵管制作]为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐(如不平齐，应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。[洗卵管制作]1）&&点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。2）&&当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。3）&&为吸管评分，轻柔地折断吸管，辨别其声音是否清脆，或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。4）&&解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管，并对其进行调整，确定其口径以及管口光滑平整。[移卵管的制作]
用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是，这些吸管的口径稍微小一些，大约150m(150-160m)，直径比单受精卵的口径略大一些，将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤，同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。管口要平且要钝化。[凹玻片的准备]必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培养皿做注射槽，载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下：1）&&在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上，矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜，将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上，在低倍镜下调节焦距，使M2溶液液滴的底面清楚为止。2）&&覆盖矿物油的作用：防止液滴脱水以及浓缩；使受精卵处于无菌状态；固定M2溶液液滴。3）&&从孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次，调整实验用量，将其置于凹玻片的M2溶液中，调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓，并且保证受精卵有足够空间自由移动，用持卵器将卵汇聚到一起，移卵时注意不要将气泡移入，影响操作视野。[显微注射设备]显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测，显微镜两侧各置一台显微操作仪，一侧接持卵管，另一侧接注射针，可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器，通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后，进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统（major instruments.co.Ltd）等，具体操作程序按其说明书严格进行。（3）注射针内DNA的装载
把注射针的钝性头浸在盛待注射DNA的管中，溶液通过毛细吸管的虹吸作用进入注射针。注射针的末端应该一直留在DNA溶液中直到注射针末端有小泡形成。这说明DNA溶液装载完毕。仔细检查注射针针头末端，距其几毫米处可见一个小凹液面。最后可将载满DNA溶液的吸管装在持针器或固定在器械环中待用。（4）受精卵的显微注射受精卵的显微注射过程相对简单，制作大量样品过程中，为保证显微注射量的一致性，必须通过大量反复有效的练习才可以成功。1）&&置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。2）&&调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。3）&&挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。4）&&如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。5）&&移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。6）&&对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。7）&&维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。8）&&保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下：①&&注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。②&&一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。③&&注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。④&&若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。9）&&用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。5．受精卵的输卵管转移（1）受精卵的输卵管注射1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。4）&&用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。
受精卵图11-1
移卵管的装载过程5）&&手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。6）&&轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。7）&&用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。8）&&一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。9）&&在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。10）&&移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。（2）注射后期监护：手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高，所以手术后必须严密监护至少2小时，同时推荐进行保温处理。
处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹，而且笼中加垫草垫以及软材料，并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。
手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良，表现厌食，脱水，或明显弓背，通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水，可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转，最终采用安乐死进行。（四）转基因小鼠的鉴定产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。1．&&转基因整合检测鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DNA，检测其基因型。检测方法包括PCR和Shouthern 杂交。（1）&&基因组DNA的提取：1）&&将离乳期小鼠（&4周龄）麻醉标记。2）&&用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。3）&&将剪下的鼠尾放入500l消化缓冲液中（50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS）, 并加入蛋白酶K使其终浓度为100 g/ml，550C下震荡孵育3~4 小时或过夜孵育。4）&&加入5 l RNA酶A，370C孵育1~2小时。5）&&DNA的分离纯化步骤参见第一章的第三节。 （2）&&PCR检测： 转基因的初始筛选通常采用PCR检测技术。该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DNA或其它标本的基因组DNA的污染。假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。PCR实验应采用双复管，甚至三复管。阳性结果最好用Southern杂交技术进一步证实。
PCR的实验操作参见第一章的第六节。（3）&&Southern blot分析：该技术虽然没有PCR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。Southern blot的实验操作参见第一章的第八节。2．&&转基因表达检测转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。其检测包括RNA分析技术和蛋白质检测技术。（1）&&RNA的分离：根据实验者的需要从转基因小鼠组织或细胞中提取总RNA或mRNA。分离总RNA比较简单，且适合做基因做基因转录分析。实验操作参见第一章的第四节。（2）&&Northern 印迹分析：该技术用于定性检测转基因动物组织或细胞中转基因转录的相对水平。其实验操作参见第一章的第九节。（3）&&RT-PCR检测：该技术可定量或半定量检测转基因小鼠组织或细胞中转基因特异表达的mRNA，且非常敏感，Northern 印迹未能检测到的转录子，该技术亦可检测到，甚至可测出1000个细胞中的一个拷贝的转录子。其实验操作参见第三章第一、二节。（4）&&Western 印迹分析：该技术通常用于转基因小鼠组织或细胞中转基因编码蛋白的表达水平。其实验操作参见第一章第十节。（5）&&免疫组织化学分析：该法可检测转基因编码蛋白表达在转基因小鼠中的组织分布。有多种实验方法，可参看相关的免疫学检测技术书籍。附录：特殊实验溶液的配制1. M16溶液：称取 0.5534 g NaCl，0.0356 g KCl，0.0162 g KH2PO4，0.0294 g MgSO4&#O，
0.0252 g CaCl2&#O，0.32 ml乳酸钠(60% 糖浆)，0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖，0.0010 g酚红，0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超纯水，0.22m滤膜过滤除菌，分装后40C储存不超过3周，加入4 mg/mL BSA可立即使用。2. M2 溶液：称取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4&#O,0.0252 g CaCl2&#O,0.32 ml 乳酸钠(60% 糖浆), 0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖,0.0010g酚红 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超纯水，0.22m 滤膜过滤除菌，分装后40C储存不超过3周。M2用于孵箱外卵的操作，用HEPES调节pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。3.工作液：无丙酮酸钠的高糖（4500 mg/mL）DMEM。具体配制见说明书4.注射缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 调节pH 为7.5.
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小鼠明暗穿箱实验的标准操作规程(SOP)
关键词（必填项目）： 小鼠明暗穿箱实验目的（必填项目）：本操作规程是关于利用小鼠明暗穿箱实验对受试物的抗焦虑活性进行药理学评价的具体操作规程。背景知识（选填项目）：无原理（选填项目）：动物置于明箱中央，背朝隔板。暗箱红灯不通电，明箱白炽灯照明。造成动物焦虑。主体内容（操作步骤，必填项目）：实验的准备实验的器材、仪器、药品仪器：分析天平，摄像仪，录像机，监视器，小鼠明暗箱（为一个上面敞开的箱子(45cm×27cm×27cm),内部分为明箱和暗箱，明箱占箱子的3/5，暗箱占2/5，有一个高出箱壁20cm的隔板分开，隔板的底部开一个7.5cm×7.5cm的方口。明箱内涂成白色，由一个60W的白纸灯泡照明，灯泡高出箱子17cm.暗箱内涂成黑色，上方17cm置一个不通电的红色灯泡。箱子底部划上边长9cm的方格。）。器材：红灯（25W），白炽灯（60W）秒表。&&药品：受试药、阳性对照药。实验动物 使用昆明种小鼠，雄性，体重范围在18~22g之间。饲养于12h一个循环的反向明暗转换的环境中（7am关灯）10d。实验开始前5-7d每天抚摸动物1-2min，减少无关刺激对实验的影响。对一般体征进行观察，选用健康状况良好的动物供实验使用。溶媒的配制根据受试物的性质选择适当溶媒，配制后在容器标签上记录名称、使用期限、配制日期、配制人。受试物及阳性对照物的配制实验当日给药前将受试物及阳性对照物用溶媒充分溶解或混悬，根据给药剂量及给药容积配制成所需浓度的均匀的溶液或混悬液。阴性对照物原则上以配制受试物及阳性对照物时使用的溶媒作为阴性对照物。实验操作规程（附加资料I）
1 分组 将小鼠称重后记录体重，按体重随机分组，每组10只。2 给药 经口给药,给药容积为0.1-0.2ml/10g，各组实验动物的测试呈正反交替顺序进行，记录给药时间。3 致焦虑 给药适当时间后，将小鼠置于明箱中央，背朝隔板。实验于10am至2pm安静环境下进行，暗箱红灯不通电，明箱白炽灯照明。每只小鼠测试后迷路用湿海绵彻底清洗并擦干。4 记录实验过程 通过明暗箱上方的摄像机及与隔壁房间相连的监视器和录像机观察和记录5min内小鼠的活动情况。5 数据读取
由不知情的熟练实验人员观看实验录像带，分别记录小鼠穿箱次数、在明箱停留的时间及总穿格次数。结果判定 1 穿箱次数穿箱次数以平均值标准差表示。2 明箱停留时间明箱停留时间以平均值标准差表示。3 总穿格次数总穿格次数以平均值±标准差表示。数据统计方法在对照组和给药组之间以穿箱次数、明箱停留的时间及总穿格次数分别进行Student’s
t检验，判断给药后有无显著性差异。 参考文献（附加资料II）Nicholas M. Barnes, Celine H.K.Cheng, et al: Prpfiles of interaction of R(+)/S(-)-zacopride and anxiolytic agents in a mouse model. European Journal of Pharcology,218(
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实验动物尿液采集的标准操作规程(SOP)关键词:尿液采集
操作规程目的：采集各种实验动物的尿液,以用于实验背景知识：无原理：无主体内容：常用的采集方法较多，一般在实验前需给动物灌服一定量的水。(一)代谢笼法：此法较常用，适用于大、小鼠。将动物放在特制的笼内。动物排便时，可以通过笼子底部的大小便分离漏斗将尿液与粪便分开，达到采集尿液的目的。由于大、小鼠尿量较少，操作中的损失和蒸发，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可造成较大的误差，因此一般需收集5小时以上的尿液，最后取平均值。 (二)导尿法：常用于雄性兔、狗。动物轻度麻醉后，固定于手术台上。由尿道插入导尿管(顶端应用液体石蜡涂抹)，可以采到没有受到污染的尿液。(三)压迫膀胱法：在实验研究中，有时为了某种实验目的，要求间隔一定的时间，收集一次尿液，以观察药物的排泄情况。动物轻度麻醉后，实验人员用手在动物下腹部加压，手要轻柔而有力。当加的压力足以使动物膀胱括约肌松驰时，尿液会自动由尿道排出。此法适用于兔、狗等较大动物。(四)输尿管插管法：动物麻醉后，固定于手术台上。剪毛、消毒，于耻骨联合上缘之上在正中线做皮肤切口(长约3～4cm),沿腹中线切开腹壁及腹膜,找到膀胱翻出腹外。辨认清楚输尿管进入膀胱背侧的部位(膀胱三角)后，细心地分离出两侧输尿管，分别在*近膀胱处穿线结扎。在离此结扎点约2cm 处的输尿管近肾段下方穿一根丝线。用眼科剪在管壁上剪一斜向肾侧的小切口，分别插入充满生理盐水的细塑料管( 插入端剪成斜面)，用留置的线结扎固定。可见到尿滴从插管中流出( 头几滴是生理盐水)，塑料管的另一端与带刻度的容器相连或接在记滴器上， 以便记录尿量。 在适用过程中应经常活动一下输尿管插管，以防阻塞。在切口和膀胱处应盖上温湿的生理盐水纱布。(五)膀胱插管法：腹部手术同输尿管插管。将膀胱翻出腹外后，用丝线结扎膀胱颈部，阻断它同尿道的通路。然后在膀胱顶部避开血管剪一小口，插入膀胱漏斗，用丝线做以荷包缝合固定。漏斗最好正对着输尿管的入口处。注意不要紧贴膀胱后壁而堵塞输尿管。下端接橡皮管插入带刻度的容器内以收集尿液。(六)穿刺膀胱法：动物麻醉后固定于手术台上，在耻骨联合之上腹正中线剪毛，消毒后进行穿刺，入皮后针头应稍改变一下角度，以避免穿刺后漏尿。(七)剖腹采尿法：同穿刺法做术前准备，皮肤准备范围应大一点。剖腹暴露膀胱，操作者的左手用无齿小平镊夹住一小部分膀胱，右手持针在小镊夹住的膀胱部位直视穿刺抽取尿液。可避免针头贴在膀胱壁上而抽不出尿液。(八)反射排尿法：适用于小鼠，因小鼠被人抓住尾巴提起时排便反射比较明显。故需采取少量尿液时，可提起小鼠，将排出的尿液接到带刻度的容器内。主要参考:我们学校动物实验中心的实验动物各种体液、骨髓的采集方法
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转载：《制药企业GMP实施与认证指南》中的范例 名称：注射用青霉素钠家兔热原实验法标准操作规程(SOP)关键词：注射用青霉素钠 家兔热原实验法 标准操作规程目的：通过家兔热原实验法对注射用青霉素钠进行热原检查背景知识：略原理：略主体内容：家兔热原实验法（1）试验动物：家兔 ①供试家兔应健康无伤、肛门正常、毛色光滑，体重1.7～3.0kg，雌雄皆可，雌者无孕，分笼饲养，预测体温前一周应用同一饮料，在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄不得有异常现象；②检查供试品前3～7日应以下列试验用兔预测体温，进行挑选：新兔；上次试验升温达0.6℃休息两周以上的试验兔，三周未曾使用的试验兔。挑选试验的条件与检查供试品相同，仅不注射药液，测体温时，体温计插入肛门的深度各兔应相等，约6cm，每1小时测理体温1次，，共测4次，体温均在38.0～39.6℃范围内，且最高最低体温的差数不超过0.4℃为符合规定，方可供试验用。每只家兔用于热原试验体温的次数不超过10次；（2）试验前的准备工作：①用具的洗涤与灭菌 a 洗涤：注射器、称量瓶用水冲洗后放入清洁液中浸泡，取出用水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗至少3次，注射针、称量勺、镊子用水冲冼后，在2%NaNCO 溶液中煮沸10-15分钟，再用不冲洗干净后用蒸馏水冲洗至少3次；b灭菌：将洗干净的注射器、注射针、称量瓶、镊子置于铝盒中，放于250℃加热30分钟，放冷密闭保存备用；②供试品溶液的制备：a精密称取青霉素钠（钾）适量，加灭菌无热原注射用水溶解成每1ml含24mg的溶液；c制备好的供试液放入恒温水浴箱中38℃预热待检；（3）操作方法：①将预选合格的家兔装入固定器中，应防止骚动，30分钟后能开始第一次测温；②测温时轻轻提取兔尾，将有润滑剂的肛门温度计缓缓插入肛门，至少2分钟后温度计读数、记录；③间隔30～60分钟后，第二次测温，同一只家兔两次预测体温之差不得超过0.2℃方可作试验用，以再次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔体温应在38～39.6℃的范围内；④将试验兔分组，初试3只，复试5只，组内各兔正常体温之差不得超过1℃；⑤预测体温后15分钟内自兔耳静脉缓缓注入已制备的供试液，注射前用75%的酒精擦兔耳边缘，注射剂量为青霉素钠（钾）注射用每公斤体重0.5ml，氨苄西林钠、注射用氨苄西林钠每公斤体重1ml，注射后用手捏住针眼处，以助止血，每批供试品可用同一支注射器；⑥注射完结后，每隔1小时测量体温1次，共测3次，取3次中最后体温减去平均体温，即为该兔体温的升高度数；（4）结果判定：①在初试3只家兔中，升温均在0.6℃以下，且3只升温总数在1.4℃以下，或在复试5 只兔中升温0.6℃或0.6℃以上的兔数不超过1只，且初复试合并的8只兔的升温总数不超过3.5℃时为符合热原检查规定；②初试3只兔中，若有1只兔升温0.6℃或0.6℃以上或3只兔升温均低于0.6℃但升温总数达1.4℃或1.4℃以上时应另取5只兔复试；③初试3只兔升温0.6℃或0.6℃以上兔数超过1只或在复试5只升温0.6℃或0.6℃以上兔数超过1只，或在初、复试中合并8兔升温总数超过3.5℃时为不符合热原检查规定；（5）注意事项：①热原试验室内外均应保持安静，避免强烈的日光、灯光、噪音及其他刺激；②试验室温度为17～28℃之间，试验过程中，室温变化不超过5℃；③复试时宜取试验次数较少的家兔；④试验过程中，家兔因肛门出血过多造成升温或降温超过规定时，可考虑重试；⑤试验全过程中，不得随意更换肛门温度计。主要参考文献：略
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fuzj_arthur 编辑于
实验动物热原的标准操作规程(SOP)关键词:家兔热原实验法 标准操作规程目的：通过家兔热原实验法对药品进行热原检查背景知识：无原理：无主体内容：1.目的
建立热原检查法标准操作规程，指导操作者正确操作，确保检验结果的准确性。2.范围
适用于药品的热源检查——家兔法。3.责任者
质量保证部门对本SOP的实施负责。4.规程
制定依据：《中国药典》2005年版二部附录ⅪD；中国药品检验标准操作规程（2005年版）。4.1实验材料及用具4.1.1
精度0.01 mg或0.1mg
供试品称量用
精度0.1 mg或1mg
试剂称量用
家兔称重用4.1.2&&电热干燥箱（50～300±1）℃。4.1.3&&恒温水浴（37～100±0.5）℃。4.1.4&&热原测温仪或肛门体温计，精度0.1℃。4.1.5&&家兔固定盒
盒的两侧有通气孔。4.1.6&&实验用具
注射器、烧杯、三角瓶、大称量瓶、吸管、移液管、表面皿、玻璃棒、广口试剂瓶、金属制密封器（均需去热原）、时钟、直镊、脱脂棉或细软卫生纸。4.1.7&&试剂
75%乙醇、凡士林或50%甘油、生理盐水、灭菌注射用水（经细菌内毒素检查,含内毒素低于0.25EU/ml）、无热原氯化钠（经250℃30分钟或200℃1小时或180℃2小时加热除热原）。4.2&&溶液配制
供试品溶液4.2.1&&原料药4.2.1.1&&精密称取适量，置烧杯、三角瓶或称量瓶中。4.2.1.2&&按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或生理盐水，搅拌使溶解。4.2.2&&注射液4.2.2.1&&用75%乙醇棉球消毒安瓶颈部，割开安瓶。4.2.2.2&&精密量取一定量药液。4.2.2.3&&按规定浓度，加精密量取的一定量灭菌注射用水或生理盐水，混匀。4.2.3&&粉针剂4.2.3.1&&用75%乙醇棉球消毒安瓿颈部或小瓶瓶塞。4.2.3.2&&加入一定量规定的溶媒配成所需浓度。4.3&&实验动物4.3.1&&健康无伤、体重1.7～3.0kg、同一来源、同一品系家兔，雌兔应无孕，1兔1笼，标兔号。4.3.2&&新兔预选4.3.2.1&&新免经饲养7日后，进行预测体温，测温的条件与热原检查要求相同。4.3.2.2&&测量体温时，测温仪探头或肛门计插入肛门的深度各兔应相同约6cm，测温时间不得少于1.5分钟。4.3.2.3&&每30分钟测温1次，共8次。4.3.2.4&&8次体温均在38.0～39.6℃（一般多选用38.4～39.4℃）的范围内，且最高最低体温差数不超过0.4℃（以不超过0.35℃为佳）的家兔，可供3周内实验用。4.3.2.5&&录选新兔编号、登记入兔史记录卡，未被录选家兔，可饲养7日再予测体温1次，如仍不符合要求则淘汰。4.3.3&&家兔的重复使用4.3.3.1&&供试品判定为符合规定的家兔，至少应休息2日，方可供下一次实验用。4.3.3.2&&供试品判定为需重复实验的家兔，应暂作休息处理，如重复合格，升温≥0.6℃的家兔，应重新测温挑选。4.3.3.3&&供试品判定为不符合规定的，家兔不再使用。4.3.3.4&&每一家兔的使用次数，最多为10次，体重逐渐减轻或超过3.0kg的家兔，不再使用。4.3.4&&复试用家兔
挑选体重在2.0～2.4kg、正常体温在38.8～39.2℃、使用过2～3次的家兔进行实验。4.4&&试验前的准备4.4.1&&测温仪或肛门温度计每3～6个月校验一次，不符合要求者不能使用。4.4.2&&用具的除热原
清洗干净的玻璃器皿、注射器、针头、直镊等放入金属制容器内，密闭，置电热干燥箱中经250℃30分钟或200℃1小时或180℃2小时加热除热原。去除热原未曾开启的密封容器内用具，可供一周内使用。4.4.3&&实验室的温度4.4.3.1&&实验室的温度应在17～28℃范围内。4.4.3.2&&实验室与饲养室的温度相差不得大于5℃。4.4.3.3&&试验全过程中，室温变化不得大于3℃。4.5&&检查法4.5.1&&选符合规定的家兔，停止给饲料和水，称重后置于家兔固定盒内至少1小时。4.5.2&&每隔30分钟测量家兔体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。4.5.3&&当日使用的家兔，正常体温应在38.0～39.6℃范围内，且各兔间相差不得超过1℃。4.5.4&&每个供试样品用家兔3只，在测定正常体温后15分钟内给药。4.5.4.1&&每个供试品的剂量，应按各该药项下的规定注射，未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算（人按50kg计），用临床一次剂量的3～10倍。4.5.4.2&&供试品注射的体积，按家兔体重每kg不小于1ml，不大于10ml。体积在5～10ml/kg的溶液应在37～38℃预热后注射。4.5.4.3&&供试品配制完毕后，应在30分钟内注射于家兔体内。4.5.4.4&&注射前，先用75%乙醇棉球轻擦耳静脉的注射部位，从耳尖端静脉进针，如进针不利，应顺序向前进行。4.5.4.5&&注射完毕，拨出针头时，按住针孔数秒钟，止血。4.5.4.6&&需缓慢注射的药液，注射时间（除另有规定外）一般每兔不超过5分钟。4.5.5&&给药后每隔30分钟测量体温1次，共6次。4.5.6&&温差计算4.5.6.1&&注射药液后，以6次测得体温中最高的一次减去正常体温，为该兔体温的升高度数，如6次体温均低于正常体温，则升温度数以“0”计。4.5.6.2&&6次体温中最低的一次，减去正常体温，即为降温值。4.6&&结果判断4.6.1&&判断复试4.6.1.1&&初试3只家兔中仅有1只体温升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔升温均低于0.6℃但升温的总数达1.4℃或1.4℃以上；应另取5只家兔复试。4.6.1.2&&含有热原的供试品，一般在给家兔静脉注射后1～2小时出现升温高峰，当第3小时升温≥0. 6℃时，宜复试后再作判断。4.6.1.3&&3只家兔中有1只降温≥0. 6℃，或3只家兔中有2只降温值在0.45～0.55℃，应另取3只家兔复试。4.6.2&&判断合格4.6.2.1&&初试3只家兔中，体温升高均在0. 6℃以下，并且3只家兔升温的总数在1.4℃以下可判断为符合规定。4.6.2.2&&复试5只家兔中，体温升高0. 6℃或0. 6℃以上的家兔数仅有1只，并且初复试合并，8只家兔的升温总数为3.5℃或3.5℃以下，可判断为符合规定。4.6.3&&判断不合格4.6.3.1&&初试3只家兔中，体温升高0. 6℃或0. 6℃以上的家兔数有2只或3只，可判断为不符合规定。4.6.3.2&&复试的5只家兔中，体温升高0. 6或0. 6℃以上的家兔有2只或2只以上，可判断为不符合规定。4.6.3.3&&初复试合并8只家兔的升温总数超过3.5℃，可判断为不符合规定。4.6.4&&新兔购买记录卡。4.6.5&&热原检查兔史记录卡。4.6.6&&新兔预测体温记录表。
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小鼠肺泡灌洗标准操作规程关键词（必填项目）： 肺泡灌洗；细胞分类计数；细胞因子目的（必填项目）：检查小鼠各种病理生理状态(特别是肺部疾病)下，肺部
出现的各种病理改变。
例：哮喘模型中检测嗜酸细胞的分类数有否提高，灌洗
液中各种细胞因子，如IL-4,IL-5,IL-10,IFN-r等水平。主体内容（操作步骤，必填项目）：实验的准备 实验的器材、仪器、药品：4℃遇冷的单纯PBS和4℃遇冷的含1%BSA的PBS；
手术器械：眼科剪，眼科镊，穿刺针或4号半头
皮针；血细胞计数板；低温离心机实验操作规程：灌洗分单侧和双侧。单侧一般为颈部和胸部解剖，气管和一侧肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端，0.3mlPBS反复冲洗,一般为3遍，每遍冲洗次数根据需要决定，一般3-5次即可。
双侧灌洗则只需要进行颈部解剖，暴露气管进行插管。PBS灌洗量增高到0.8ml.灌洗次数同上。结果判定：1.回收的灌洗液4℃，1500r离心10分钟，回收上清置于-20℃等待进行细胞因子检测；
2.用1ml含有1%BSA的PBS重悬细胞沉淀，取10ul重悬液进行细胞计数。余液再次4℃离心，参数同上；
3.离心后去上清，不需太彻底，可根据第二步细胞计数所得结果和需要涂片张数决定需要残留多少上清重悬细胞沉淀。一般如果细胞总数有10*6次方/ml的话，用80-100ul重悬可以涂三张片，这样玻片上细胞密度比较适中。
4.涂片后待玻片自然晾干，然后置于10%中性甲醛溶液中固定10分钟以上，随后就可以进行常规HE染色。
5。染色后就可以进行细胞分类计数，计算300个以上细胞，结果就比较可靠了。谢谢，不当之处请多指点！
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fengsir 编辑于
名称：测定大鼠心肌AGEs含量标准操作规程(SOP)关键词：大鼠心肌；AGEs含量目的：观察糖基化终末产物的生成量，用于判定药物对糖尿病心肌病大鼠的疗效。主体内容： 制备心肌匀浆组织后→离心（3000rpm，10min，4℃）→弃上清，沉淀物用去离子水洗3次，加入5ml氯仿-甲醇（2：1）→放入摇床内，4℃振荡过夜后，加入2ml甲醇，0.5ml去离子水→离心（3000rpm，10min，4℃），分别用甲醇，去离子水水化，冲洗→Hepes缓冲液冲洗2次后，将其放入5ml的Hepes缓冲液，4℃过夜→离心（3000rpm，10min，4℃），祛缓冲液→加入1ml包含Ⅴ型胶原酶（290U/ml）的Hepes液中，加入防腐剂（甲苯2&l，氯仿2&l）→放于摇床内，常温振荡消化24小时→离心获取上清液，避光静置1h→用荧光分光光度仪在370/440波长下测定荧光强度，其值用空白胶原酶校正。AGE含量以每mg羟脯氨酸（HYP）所含荧光强度为一个任意单位，用AU（arbitrary unit）表示，即AU/mgHYP。
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名称：骨髓细胞的提取和分离关键词：mscs 提取和分离目的：提取骨髓中间充质干细胞并培养主要内容：步骤一：小鼠或大鼠骨髓细胞的获取1．&&断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2．&&用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3．&&小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4．&&拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5．&&&300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6．&&加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7．&&&300C离心，1200转/10分钟，去上清。
步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1．&&按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2．&&细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3．&&小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4．&&如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5．&&离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数然后铺板培养
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名称：大鼠灌注取脑 标准操作规程(SOP)关键词：大鼠
灌注取脑目的： 完整取出大鼠脑部（取材）操作步骤流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.1 多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。我们用的方法：加热至60～65℃固然融解的快，不过容易挥发，气味难闻，不是好的选者。我们是这样做的，感觉不错，在此强烈推荐：先配好pbs，称好相应的多聚甲醛，37c水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。 3 麻醉后开胸：暴露充分些容易心脏穿刺及剪开右心耳。箭头所指为右心耳。 4心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血。 5 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。6 先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。 7 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。 8 分离除去后颈部肌肉 。9 用弯钳仔细剔除颅骨 。
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名称：大鼠幽门结扎性溃疡(pylorus ligated gastric ulcer) 标准操作规程(SOP)关键词：大鼠
幽门结扎性溃疡目的：制备溃疡病模型,评价抗溃疡药的作用原理：大鼠幽门结扎后胃液滞留,胃酸和胃蛋白酶对胃粘膜长时间消化,引起溃疡主体内容：1.器材：手术剪，缝合线(粗)，持针器，皮镊子，止血钳。铁丝鼠笼。手术灯，缝合用25 W照明灯3个。乙醚，麻醉钟罩及麻醉口罩。标本固定瓶，平皿。10%福马林。大鼠手术台4个。分光光度计。生理盐水。2.溃疡指数测定
大鼠60只，体重150-250 g均可，一批实验体重范围&50g, ♂♀均可。
随机分为以下6组:
第1组:对照组， 生理盐水 5 ml/kg
第2组:赋形剂组
第3组:法莫替丁
第4组:受试药
第5组:受试药
第6组:受试药
高剂量另取大鼠4只，为卫星组，处理同对照组，于手术后14、16h各处死2只，动态观察溃疡形成情况。给药时间：如考虑为局部作用者，可术前给药；如为吸收作用者，结扎后在12指肠内给药。大鼠禁食(不禁水)
48-72小时时在乙醚麻醉下结扎幽门。碘伏消毒皮肤，在剑突下一横指以下正中切一1 cm纵行切口，注意切开皮肤时先轻后重，以免割伤肝脏。止血钳钝行撑开腹膜，用止血钳（头子上穿硅胶管）夹出胃及十二指肠，找出胃和十二指肠交界处，在十二指肠下避开血管穿双线线（用缝合针），用双线结扎。注意结扎时确保线置于幽门与十二指肠连接处，如结扎位置低时，十二指肠液反流，可使病变减轻。间断缝合腹壁肌肉和皮肤（各三针）。每组结扎开始及结束时均记录时间。术后禁食、禁水，结扎后14-18小时（一般为18h）颈椎脱臼处死（处死时间视卫星组大鼠形成溃疡而定）， 将10%福马林注入胃内，固定30分钟后取胃沿胃大弯剪开，平铺后用摄象机摄象(放大7倍)，用真彩色图象分析仪测量溃疡面积(ulcer area)，按Okabe法计算溃疡指数(ulcer index)。溃疡指数计算如下:溃疡面积(mm2 ):
≥50或穿孔溃疡指数:
5试验时间安排举例：日8:00am开始禁食，不禁水日:7:30pm开始结扎（结扎后立即十二指肠内注入药物0.5 ml/kg），术后禁食水日1：30取材。
3. 大鼠胃液分泌量、胃液酸度和胃蛋白酶的测定。
选体重为180-220 g 大鼠，雌雄各半，按性别、体重随机分组，禁食48小时，自由饮水， 灌胃给药30分钟后在乙醚麻醉下开腹结扎幽门， 6小时后收集胃液，离心分离胃液，按下法测定胃液量、胃液酸度和胃蛋白酶活性：
(1). 胃液量及胃液 pH测定:
收集离心后的胃液，用量筒测量胃液体积，用酸度计测胃液pH值。(2).游离盐酸及总酸度测定:取5 ml胃液，用酸度计监测，用0.1N NaOH滴定至pH 7.0，记录所耗用的NaOH毫升数，计算游离盐酸。然后加入1%酚酞2滴为指示剂，再继续用0.1N NaOH滴定至出现酚酞色，记录所耗用的NaOH总量，计算总酸。
游离酸(mmol/L)=滴定5 ml胃液(至pH7.0)用去0.1N NaOH(ml) ×20
酸(mmol/L)=滴定5 ml胃液(至出现酚酞色)用去0.1N NaOH(ml)×20
总酸排出量(mmol/L•h)=总酸度×胃液体积÷6
(3)胃蛋白酶活性测定
取离心胃液0.1ml，加入1%牛血清白蛋白(0.1 N NCl配制) 1 ml.37℃温孵20分钟，加入2 ml 1%三氯乙酸，并在沸水中加热5分钟，冷却后过滤，取滤出液0.2ml，加入2 ml 0.1 N
HCl、3.5 ml 0.6 N NaOH溶液，同时加入稀释后的Folin-酚试剂1.5 ml， 混匀、静置10分钟后在680 nm处测光密度。以酪氨酸标准曲线计算胃蛋白酶活性。以μmol/h酪氨酸表示胃蛋白酶排出量。胃蛋白酶活性单位规定为每分钟生成 1 μmol 酪氨酸作为1个活性单位。
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名称:小鼠角叉菜胶性足肿模型制备标准操作规程目的：制备小鼠角叉菜胶性足肿模型，筛选抗炎药的抗炎作用关键词:小鼠
抗炎原理:角叉菜胶为常规致炎剂,小鼠足跖皮下注射能引起炎症渗出,使致炎侧重量增加,称取2侧足重的差别,即可考察炎症的程度和抗炎药的作用.主体内容:一、模型制备　体重18～22 g的昆明种小鼠，♀♂不拘，随机分组，左后肢分别im 受试药、地塞米松 2 mg/kg或生理盐水（或溶媒），于给药后30 min时在每鼠右后足跖sc 1%角叉菜胶30 μl致炎。5 h后处死小鼠，从踝关节处对称剪下鼠足，称重，以左、右足重量差作为鼠足肿胀度。二、注意事项：1.注射角叉菜胶后5 h肿胀度约70 mg, 24 h时肿胀度可达100 mg以上。2.角叉菜胶注射后12 h时给抗炎药，24 h时取足称重，地塞米松 1 mg/kg im未显示出疗效。致炎前给药，地塞米松2 mg/kg 抑制率达40%。3.剪炎足以髁关节处骨性标志为准，务必左右对称，左右正常足剪下称重左右差应&5%。4.Sc 角叉菜胶用一次性1 ml注射器，针头为5#。注射时从远心端进针，沿正中线皮下水平进针2 mm。5.角叉菜胶研成粉细，用盐水混悬，用内切式匀浆器充分打匀。
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名称：巴豆油诱发小鼠耳肿标准操作规程目的： 研究抗炎药的抗炎作用或量效关系。关键词：巴豆油 小鼠
抗炎主体内容：[药品、试剂及配制]阳性对照药用地塞米松磷酸钠注射液， 用蒸馏水稀释至0.2 mg/ml。或用乙酰水杨酸，取乙酰水杨酸结晶，研细后用蒸馏水混悬为40 mg/ml，用前摇匀。灭菌生理盐水。巴豆油致炎合剂按下方配制：
73%受试药可用生理盐水配制。如有赋形剂，对照组应用等体积赋形剂对照。[器械与仪器]手术剪。眼科剪。1 ml 注射器。100 μl微量进样品。6.5 mm打孔器，橡胶榔头，硬木板。1/10000电子天平。小鼠灌胃器或51/2号注射针头。平皿5个，中间划线，并标上“左” 、“右” 标记。 [实验动物]昆明种小鼠，体重22-30 g均可，但每批实验小鼠体重差别不应&3 g,小鼠体重差别愈小愈有可比性。[方法]
动物分组：昆明种小鼠50只，体重25～28 g，♀、♂各半，随机分为5组:对照组：用生理盐水0.1 ml/10 g (或赋形剂) im。地塞米松组：用0.2 mg/ml 0.1 ml/10 g地塞米松溶液 im。受试物低剂量组：用受试物0.1 ml/10 g im。受试物中剂量组：用受试物0.1 ml/10 g im。受试物高剂量组：用受试物0.1 ml/10 g im。
给药及致炎：注射给药30 min后（口服药物后1h）1人固定小鼠，另一人用微量注射器吸取巴豆油致炎合剂，在右侧耳壳正反两面均匀涂以0.1 ml巴豆油致炎合剂(每面50 μl),涂巴豆油后单独隔离20 min, 以防鼠间互相污染，然后每笼5-10只饲养，注意喂水。致炎4 h后颈椎脱臼处死动物，沿耳廓基线剪下双耳，于同一部位用打孔器 (直径6.5 mm)冲下耳片，放在平皿相应标记部位，立即称重。以两耳片重量之差为肿胀度(mg)，求出肿胀抑制率(%)。抑制率(%)=（对照组鼠耳肿胀度-受试组鼠耳肿胀度）/对照组鼠耳肿胀度×100%注：小鼠左耳被巴豆油污染后重量超过10 mg, 应弃去不用。打耳片时应注意两侧对称，打孔器外缘距耳尖边缘0.5 mm左右。所打耳片不应有缺口、或粘有多余组织。有多余组织时应对准打孔器所留痕迹用眼科剪刀仔细修齐后再行称重。实验室温度应&18 ℃, 过冷则血管收缩，肿胀度变小；湿度应为40-80%，过干则导致组织脱水。本实验对照组小鼠耳肿胀度应&10 mg，并可被地塞米松（2 mg/kg，im）抑制之。
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我也写一个我们实验室的大鼠新生鼠（&P 14d）灌注取脑及后固定规则，优点是：可用单人用注射器直接完成，不用输液管架，而且平均每只仅需5～10ml固定液，时间也仅为5～10min，作为与已有的一篇成个呼应：）名称：大鼠新生鼠（&P 14d）灌注取脑及后固定规则(SOP)关键词：大鼠 新生鼠 灌注取脑 后固定目的： 完整取出鼠脑及后期固定操作步骤流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏解剖 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.1 多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有800ml PBS的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，使呈清亮状（滴加），过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。2 实验准备：准备两个10ml注射器，剪刀，弯镊、PBS 10ml/只、4%PFA 10ml/只。3 麻醉后开胸：因老鼠较小，可冰冻麻醉，或者用致死量麻醉。沿肋弓下向左右剪开，至双侧腋中线向上剪开，然后向上翻起胸壁，充分暴露心脏。4 心脏穿刺：在右心耳处用针扎出一个小孔，用装有PBS针筒在左心室进行穿刺。5 灌流：缓慢灌注PBS 10ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛，多聚甲醛的灌流也同PBS。 6 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。 7 取脑：分离除去后颈部肌肉 ，用弯镊小心取出脑组织。8 后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间&2h，过夜最好。
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seaky 编辑于
名称：C6鼠脑胶质瘤模型的建立关键词：胶质瘤模型 立体定向目的：建立C6鼠脑胶质瘤模型主体内容：操作步骤，必填项目 　将SD大鼠以10%水合氯醛0.3ml/100g （300mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于立体定向头架,将1.0×106细胞悬液10μl以微量注射器注射于大鼠右侧尾状核(手术暴露颅骨标志，以牙钻于前囟右旁开4mm,前1mm,孔径1.2mm，硬膜下进针深5mm)。接种的C6细胞经胰蛋白酶消化，按设计的接种细胞数，将细胞重悬于无血清的DMEM培养基中，接种间期置于4℃暂存。注射时间约为10分钟，留针5分钟，使细胞充分沉积,以骨蜡封闭颅骨钻孔后缝合。附图：
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lxzhi7997 编辑于
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屏障动物房中IVC的标准操作规程(SOP)关键词:屏障动物房 IVC目的：本操作规程是关于屏障动物房中饲养小鼠的具体操作规程背景知识：屏障作用
IVC原理原理：无主体内容：1.提前15分钟用70%酒精喷雾动物笼具交换工作站内表面，同时放入经表面消毒的各种灭菌饲养和实验用品，并打开紫外灯，开启超净工作台风机。2.关闭紫外灯，打开照明灯。3.用70%酒精喷雾工作车。4.用双手轻轻抬起IVC 笼盒外端，沿笼架搁挡向外移出笼盒，放在工作车上。5.将工作车推至动物笼具交换工作站旁。6.用70%酒精喷雾双手手套外表及IVC 笼盒的外面。7.打开超净台移门（高度只要能使笼盒进入即可），移入笼盒。8.适当下拉动物笼具交换工作站移门（高度只要操作者二手在台中活动自如即可），打开IVC 盒盖底之间的紧箍扣并打开笼盖，侧卧放在一边。9.换窝，喂饲，喂水，实验9．1换窝：每三天换窝。在动物笼具交换工作站中，用消毒灭菌过的大镊子（平时大镊子可一直浸泡在0.1%新洁尔灭中，每次工作后换液或用酒精灯烧灼），夹住动物尾巴，把动物移至新的笼盒，盖上金属网盖，添满饲料，盖上盒盖，扣上紧固扣，把原笼盒上的动物卡片移至新的笼盒上。9.2喂饲：每天三喂饲。在动物笼具交换工作站中，剪开辐照饲料铝铂包装，取出内袋，打开，倒满料斗即可。喂饲无须打开金属盖。9.3喂水：每两天更换水瓶。在动物笼具交换工作站中，拔下旧水瓶，插上新的灭菌水瓶即可。换水瓶无须打开盒盖。9.4动物实验：在动物笼具交换工作站中，再次用70%酒精消毒带有乳胶手套的双手，从笼盒中取出动物，放在小动物手术台上对动物进行实验处理。10.做完超净工作台中的饲养和实验工作，盖好笼盒，打开动物笼具交换工作站移门，取出笼盒，放在IVC 笼架上原位，对准笼架进出风口，沿笼架搁挡，轻轻推入进出风接口。11.工作完毕后整理，并用70%酒精消毒超净工作站台面，最后关闭电源。12.换窝，喂饲，喂水，实验，以及其他涉及打开笼盖或无菌操作的地方都必须在超净工作站内进行。14.其他操作与工作程序按一般屏障动物房要求进行。
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名称：净化工作工作台 标准操作规程(SOP)关键词：净化工作工作台目的：净化工作工作台的使用 主体内容：
1、使用工作台时，应提前15min开机，同时开启紫外杀菌灯，处理操作区内表面积累的微生物，30min后关闭杀菌灯，此时日光灯即开启。
2、新安装或长期未使用的工作台，使用前必须对工作台和周围环境先用超净真空洗尘器进行清洁，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。
3、操作区内不允许存放不必要的物品，以保持操作区的洁净气流流型不受干扰。
4、操作区内尽量避免作明显扰乱气流流型的动作。
5、操作区使用温度不得大于60℃。
6、定期（一般每二月一次）用QDF-2A型热球式电风速计测量操作区风速。
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名称：生物样品的采集及实验动物的解剖和脏器系数测定标准操作规程(SOP)关键词：生物样品的采集
脏器系数测定目的：在药物毒理学研究中，常常需要收集实验动物的血液、尿液或其它体液进行常规检查或生化分析，因此，正确采集实验动物的生物材料是药物毒理学最基本和最重要的操作技术。对实验动物进行大体解剖检查是药物毒理实验的常规观察项目，简便易行并能提供重要资料。测定动物死后器官湿重和含水量是常用的指标之一，可以从大体标本大概地估计内脏器官病变的程度，特别适用于某些可致内脏水肿、实质细胞肿胀、间质纤维组织增生或脏器萎缩等药物的研究。组织匀浆的制备以及在匀浆技术的基础上发展起来的亚细胞结构分离技术，也是药物毒理实验的重要技术之一。学习和掌握药物毒理学试验中常用的生物材料的采集方法；实验动物的处死方法、大体解剖检查、脏器系数和含水量的测定以及组织匀浆的制备；了解病理切片常规收集样本的部位和方法。 主体内容（一）血液的采集1、大鼠与小鼠的采血方法：① 鼠尾采血：当所需血量很少时采用本法。固定动物并露出鼠尾，将尾部浸入45~50℃温水中数分钟，使尾静脉充血，擦干，再用酒精棉球擦试消毒。剪掉尾尖（约0.2~0.3cm），拭去第一滴血。然后用血色素吸管定量吸取尾血，或将尾血直接滴入容器内。采血完毕用干棉球压迫止血。亦可不剪尾，用7~8号注射针头连上注射器直接刺破尾静脉采血。② 眼眶静脉丛采血：当需用中等量的血液，而又避免动物死亡时采用本法。左手拇指及食指紧紧握住大鼠或小鼠颈部，压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血，但用力要恰当，防止动物窒息死亡。右手持玻璃毛细管从右眼或左眼内眦部以45°角刺入，刺入深度小鼠约2～3mm, 大鼠4～5mm。若遇阻力稍后退调整角度后再刺入，如穿刺适当，血液能自然流入毛细管内。得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，拔出毛细管，用干棉球压迫止血。③断头采血：当需用较大量的血液，而又不需继续保存动物生命时采用本法。左手握住动物，右手持剪刀，快速剪掉头颈部，倒立动物让血液滴入容器。需注意防止断毛落入容器中。2、家兔采血方法：① 耳缘静脉采血：本法为最常用的取血方法之一，可多次反复取血。将家兔固定于兔箱中，拔掉拟采血耳缘部细毛，用手指轻轻弹耳或电灯照射兔耳，使耳部血管扩张，然后消毒。左手压迫耳根，用针头刺破静脉或以刀片在血管上切一小口，让血液自然流出。也可直接用注射器进针耳缘静脉抽取血液。采血完毕用干棉球压迫止血，如一时不易止血，可用木夹夹住耳壳10~20分钟。② 心脏穿刺采血：将家兔仰卧位固定在兔台上或由助手捉持，在左胸第2~4肋部剪毛，常规消毒。于第3~4肋胸骨左缘心跳最明显处穿刺，针头刺入心脏后即见血液涌入注射器。采血完毕迅速将针头拔出，这样心肌上的穿刺孔较易闭合，针眼处用酒精棉球压迫止血。体重2公斤的家兔每隔2~3周可重复采血10~20ml。③股动脉采血：将家兔仰卧固定在兔台上，左手拉直动物后肢，右手持注射器，以血管博动为指标，将针头刺入股动脉。若已刺入动脉，即有鲜红色血液流入注射器。抽血完毕迅速拔出针头，用干棉球压迫止血。3、狗的采血方法：① 后肢外侧小隐静脉和前肢皮下头静脉采血：本法最常用，且方便。后肢外侧小隐静脉位于后肢胫部下1/3的外侧浅表的皮下，由前侧走向后上侧，前肢皮下头静脉位于前肢脚爪上方背侧的正前方。抽血前，将狗固定在狗台上或使狗侧卧，由助手固定好。剪去抽血部位的毛，常规消毒。一人用力压迫静脉近心端或用止血带绑紧，使静脉充盈，另一人持注射器进行静脉穿刺。取得所需血量后拔出针头，以干棉球压迫止血。②耳缘静脉采血：当需少量血液或作血常规检查时，可用狗的耳缘静脉采血法。剪毛后先将狗的耳壳加热，或用二甲苯棉球擦耳壳，然后以刀片切割已扩张的血管，使血液滴入容器。采血完毕，以干棉球压迫切割口以止血。4、采集血液的注意点：① 实验动物一次采血量过多或采血过于频繁，都可影响动物健康，造成贫血甚至死亡，其最大安全采血量见表1。
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② 采血方法的选择，主要取决于实验的目的和所需血量的多少，所需血量较少时可刺破组织取毛细血管的血，当需血量较多时可作静脉采血，若需反复多次静脉采血时，应自远心端开始。③ 若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂，常用的抗凝剂有：A、草酸钾：常用于供检验用血液样品的抗凝。在试管内加饱和草酸钾溶液2滴，均匀浸湿管壁后，放入烘箱（80℃）烤干，包好备用。每管能使3~5ml血液不凝固，供钾、钙含量测定的血样不能用草酸钾抗凝。B、肝素：取1%肝素溶液0.1ml于试管内，均匀浸湿试管内壁，放入烘箱（80~100℃）中烤干。每管能使5~10ml血液不凝固。市售的肝素注射液每ml含肝素12.500 U，相当于肝素钠125mg。C、枸橼酸钠：3.8%的枸橼酸钠溶液1份可使9份血液不凝固，用于红细胞沉降速率测定。因其抗凝作用较弱而碱性较强，不适用于供化验用的血液样品。（二）尿液的收集1、一次尿收集法：在实验研究中，有时为了某种实验目的，要求每间隔一定的时间收集一次尿液，如每4小时收集一次，以观察药物的排泄情况。此种情况下，常用以下方法收集尿液。①逼尿法：本法适用于兔、猫。助手把动物抱住，操作者右手由腹腔向下逐渐用力压迫膀胱，逼出尿液。②导尿法：本法适用于兔、猫、猴和狗等动物，是较常用的方法之一。动物取仰卧位固定于手术台上，尿道口常规消毒。以左手充分暴露尿道口且固定之，右手持导尿管（尖端涂有消毒凡士林或液体石蜡）顺尿道轻而慢地插入，家兔插入约8~12cm，一旦进入膀胱腔，即见尿液流出。若无尿流出，可将导尿管适当上下左右移动，到尿液流出为止，然后用胶布将导尿管与动物体固定。③输尿管插管法：本法适用于兔、猫、猴和狗。以兔为例：将兔麻醉后仰卧位固定在手术台上，于耻骨联合上缘沿正中腹白线作一4~6cm的切口，打开腹腔，在膀胱底两侧找出左右两根输尿管，分离后于两根输尿管下各穿两根线，一根结扎近膀胱端，在结扎线上方向肾脏方向剪一小口插入导管，用另一线结扎。将两根导管的游离端一并放入量筒内收集尿液。实验过程中，应用温生理盐水纱布覆盖手术野，以保持腹腔温度。2、连续收集尿液的方法大鼠和小鼠的留尿法：在小动物的毒理实验中，常常收集24小时或某特定时间内的尿液。为此常用代谢笼配上粪尿分离漏斗收集尿液，此装置除支架外均用玻璃或有机玻璃制成，便于清洗。该装置主要包括圆形有机玻璃笼罩，带孔的圆玻璃底盘，供饮水和食料的装置，锥形集尿漏斗和粪尿分离器等。动物置于代谢笼内，粪尿分离漏斗的侧口接一只150~200ml的集尿容器收集尿液。一般