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北美大豆共生根瘤菌Bradyrhizobium群体的微进化关系及动态学分析--《四川农业大学》2012年博士论文
北美大豆共生根瘤菌Bradyrhizobium群体的微进化关系及动态学分析
【摘要】:大豆(Glycine max)是世界上最重要的豆科作物,是油和蛋白质的主要来源。慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)中的B. japonicum、 B. elkanii等能与大豆有效共生固氮,从而减低作物生产过程中对氮肥的需求。由于Bradyrhizobium群体代表了非常有用的遗传资源,加上大豆的经济价值,这让Bradyrhizobium属成为了研究的热点。加拿大的特殊地理位置,使它成为种植大豆的最北部地区,大豆产量居世界第七位。尽管大豆生产对加拿大的农业和经济有着非常重要的影响,但却没有关于大豆共生根瘤菌基因资源方面的信息,特别是缺乏代表性共生根瘤菌Bradyrhizobium种群多样性、动态学、群体结构或进化史方面的资料。研究Bradyrhizobium属的生物多样性,不仅有利于为可持续的农业生产开发新的根瘤菌资源,发掘新的根瘤菌基因资源,还可以进一步清楚地展示Bradyrhizobium属内的分类地位,揭示属内的遗传进化关系,同时还可以为大豆生产筛选高效的根瘤菌菌株。
本研究对从加拿大东部两个采样地(相距280公里,有显著不同大豆种植史和接种史)分离的Bradyrhizobium群体进行了系统的调查研究,结果如下:
1.通过植物诱捕,收集了220株共生细菌。同时,还收集了已知的在加拿大用于大豆接种的Bradyrhizobium接种菌。所有分离株具有共同的特点:在YEM培养基上生长缓慢:28℃培养7-14天后,菌落直径小于1mm:都能在大豆上结瘤。
2.成功扩增了所有供试菌株的6个看家基因,并进行了序列测定,获得了长度为435bp (atpD),555bp (glnll)、462bp (recA)、618bp (gyrB)、771bp (rpoB)和369bp (dnaK)的基因片段。各看家基因拥有的等位基因数从9(dnaK)到17(rpoB)变化,而单个基因座的遗传多样性(π)从00251(atpD)到0.0338(recA)变化。所有基因座的dN/dS平均值均小于1,表明这些基因座正处于稳定或净化选择。另外,phi test检验显示,gyrB和recA基因座存在显著的重组,而其他基因座没有检测到显著的重组。
3.220株分离株6个看家基因的合并序列组成了35个独特的多位点序列类型(ST)。其中,15个ST的分离株来源于采样地A,27个ST的分离株来源于采样地B,7个ST的分离株来源于A、B两地。其中,ST21含有最多的细菌,共有53株分离株,占所有分离株的24.1%,其次是ST15,共有36株分离株,占所有分离株的16.4%。
4.参比接种菌中,USDA136和USDA122拥有相同的ST,归入到ST4。而532C、USDA138和B. japonicum USDA6T也拥有同样的ST,归入到ST24。只有很少一部分分离株被鉴定为推定接种菌。其中,采样地A只获得了一株推定接种菌;采样地B中31%的分离株被鉴定为推定接种菌。采样地A、B均未获得与接种菌61A124相关的分离株。
5.多位点序列分析及微进化分析结果表明,与大豆共生的Bradyrhizobium群体高度结构化,并呈现出遗传多样性。所有的分析都支持将220株分离株分入5个系统分支,分别对应于是B.japonicum group1、 B.japonicum group1a以及Bradyrhizobium属内3个新的系统分支。
6. STRUCTURE分析显示,220株分离株起源于5个Ancestral Lineage。 Lineage I中的分离株全部来自采样地B,而Lineage III中的菌株全部来自采样地A,并且这两个Lineage中菌株的遗传物质都是100%来自各自的Ancestral Lineage,这为分离株的空间分布提供了有力的证据。20株分离株(分别来自Lineage Ⅱ、 Ⅳ、Ⅴ)呈现山不同程度的混合祖先,这表明Lineage (?)发生了基因漂流,但不频繁。被鉴定为推定接种菌的这些ST中,只有有ST24(532C)展现出了混合祖先,遗传物质分别来自Ancestral Lineage Ⅱ、Ⅲ、ⅠV和V,并且ST24是唯一一个来自采样地B且继承有Ancestral LineageIII遗传物质的ST。
7.一致网络图显示,220株分离株被分入了5个清晰地类群,这和STRUCTURE推断的5个Lineage完全一致。对应于LineageⅠ、Ⅱ和Ⅲ的3个类群中没有任何标准菌株,位于独立的系统分支上,表明它们是Bradyrhizobium属内新的演化谱系。 LineageⅣ和Ⅴ中观察到了中度复杂的网状结构,它们的存在及复杂程度反映了系统发育不确定性的程度,同时也暗示了重组的存在。
8. ClonalFrame分析发现,重组对系统发育的推断有显著影响。共鉴定了21个重组事件,其中,12个重组事件发生在gyrB基因座上。代表内部节点的祖先推断中,没有一个推定接种菌被鉴定为外部节点的最近祖先。所有Lineages的重组与突变比值的比率(p/0)是0.05,这表明发生重组的频率是发生突变的频率的二十分之一;重组相对于突变的作用(r/m)的值是0.59,说明突变大约2倍于重组引起核苷酸替换。 LineageⅡ的外部分支与内部分支长度比率高于预期值,说明该lineage最近经历了一次群体扩大。
9. Unifrac分析显示,Lineage间分离株频率的差异存在于采样地间(P=0.01)和栽培种间(P=0.01)。代表Lineage的分离株和代表单个ST的分离株在采样地间及大豆栽培种间的频率也有显著差异。这些都为群体的空间结构提供了证据。10.共生基因nodC序列由7个等位基因类型组成,遗传多样性(π)为0.0167,GC含量为57.3%;dN/dS平均值为0.076,说明该基因正处于稳定或净化选择;phi检验没有检测到显著的重组。一致网络图中nodC序列分入了2个明显区分的群:nod I和nod II,并且几乎没有明显的网状结构,说明nodC基因座的重组很少见。Chi-square检验结果显示,nod I中分离株的频率在采样地间存在显著差异,而nod II中分离株的频率在采样地间不显著。nod I和nod II中分离株的频率在栽培种间都没有显著差异。
11.供试菌株间的固氮有效性存在相当大的差异。一些推定接种菌的固氮效率很低,这说明这些分离株正经历固氮基因的遗传变化或它们本来就存在于土壤中,只是碰巧与接种菌拥有同样的多位点基因型(ST)。
【关键词】:
【学位授予单位】:四川农业大学【学位级别】:博士【学位授予年份】:2012【分类号】:S144.3;S565.1【目录】:
摘要4-7Abstract7-13第一章 文献综述13-30 1.1 引言13 1.2 根瘤菌多样性研究进展13-19
1.2.1 根瘤菌表型多样性研究14-17
1.2.2 根瘤菌遗传多样性研究17-19 1.3 根瘤菌的分类系统19-21
1.3.1 早期根瘤菌的分类系统20
1.3.2 现代根瘤菌的分类系统20-21 1.4 根瘤菌的系统发育研究21-27
1.4.1 根瘤菌系统发育研究历史及现状21-22
1.4.2 基因序列建立的根瘤菌系统发育关系22-24
1.4.3 根瘤菌的最新分类系统24-27 1.5 立题依据及目的27-30
1.5.1 慢生根瘤菌属Bradyrhizobium的多样性27-28
1.5.2 立题依据及目的28-30第二章 材料与方法30-56 2.1 土样来源30
2.1.1 采样地概况30
2.1.2 样品采集及保存30 2.2 仪器、试剂、培养基及营养液30-34
2.2.1 试验仪器30-31
2.2.2 主要试剂31-32
2.2.3 培养基32-33
2.2.4 营养液33-34 2.3 大豆根瘤菌的分离、纯化及保存34-44
2.3.1 共生结瘤34-35
2.3.2 根瘤的收集35
2.3.3 大豆根瘤菌的分离、纯化及保存35-43
2.3.4 供试大豆根瘤菌43-44 2.4 DNA提取、PCR扩增及测序44-48
2.4.1 基因选取策44-45
2.4.2 细菌基因组DNA提取45
2.4.3 PCR扩增及产物纯化45-47
2.4.4 PCR产物测序47-48 2.5 核苷酸序列分析48-49
2.5.1 多序列比对48
2.5.2 各基因序列多态性分析48
2.5.3 分离株的序列类型(Sequence Type,ST)48-49
2.5.4 phi检验49 2.6 Structure分析49-50
2.6.1 数据格式及参数设定49
2.6.2 群体分群数(K)的估计49-50
2.6.3 群体结构分析50 2.7 看家基因系统发育分析50-52
2.7.1 模型选择50
2.7.2 系统发育重建50-51
2.7.3 系统发育网络分析51
2.7.4 一致性检验51-52 2.8 ClonalFrame分析52
2.8.1 数据格式及参数设置52
2.8.2 重组对系统发育的影响52
2.8.3 推断重组事件52
2.8.4 推断种群历史52 2.9 Unifrac分析52-53 2.10 MLST分析53-54 2.11 共生基因nodC序列分析54
2.11.1 nodC基因序列54
2.11.2 nodC系统发育分析54
2.11.3 卡方测定54 2.12 固氮相对有效性54-56
2.12.1 供试材料54
2.12.2 豆科植物试验54-55
2.12.3 RE测定55-56第三章 结果与分析56-89 3.1 看家基因序列分析56-59
3.1.1 看家基因序列的多样性56-57
3.1.2 看家基因的序列类型及频率57-59 3.2 STRUCTURE分析59-61 3.3 大豆根瘤菌的系统发育关系61-74
3.3.1 单个看家基因系统发育分析61-69
3.3.2 Randomization Test69-71
3.3.3 系统发育网络71-74 3.4 ClonalFrame分析74-79
3.4.1 重组对系统发育推断的影响74
3.4.2 重组事件74-78
3.4.3 重组率与突变率78-79
3.4.4 最近的种群历史79 3.5 采样地及大豆栽培种的影响79-81 3.6 MLST分型81-83 3.7 nodC序列的多样性83-86 3.8 固氮相对有效性86-89第四章 讨论89-94附录194-100附录2100-101附录3101-102附录4102-103附录5103-112参考文献112-124在读期间发表科研论文情况124-125致谢125-126
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System.Web.UI.Page.ProcessRequestMain(Boolean includeStagesBeforeAsyncPoint, Boolean includeStagesAfterAsyncPoint) +3064
版本信息:&Microsoft .NET Framework 版本:4.0.30319; ASP.NET 版本:4.0.微藻优化培养、采收及沼液培养微藻的研究--《浙江工业大学》2012年硕士论文
微藻优化培养、采收及沼液培养微藻的研究
【摘要】:生物柴油可部分替代传统石化柴油,是理想的可再生能源。生物柴油的发展受到原料不足的限制,微藻是良好的生物柴油原料。以微藻为原料制备生物柴油具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高、占用耕地少等优点,成为近年来研究的热点,然而微藻生物柴油的发展受到微藻培养密度低、藻油含量不高、微藻采收困难以及微藻培养成本过高等的限制。
本文结合微藻生物柴油发展中现存问题,从微藻的优化培养、藻细胞采收和低成本培养三方面开展研究。研究了氮源、有机碳源、营养物质的添加方式对微藻生长和油脂合成的影响,并对微藻培养过程进行了优化,建立了微藻生长动力学模型;用化学絮凝法采收纤维藻,比较了几种常见絮凝剂采收纤维藻的性能,并对其絮凝机理进行了分析;利用沼液培养微绿球藻以降低微藻培养成本,并减少了富营养成分的排放。通过实验得出以下结论:
(1)微藻培养过程中,氮源对藻的生长有明显促进作用,供氮培养时小球藻和纤维藻的生长均优于缺氮培养;氮源的缺乏能提高微藻的含油率;小球藻和纤维藻能在有机碳源存在下混养生长,供氮培养在藻生长至对数期流加葡萄糖时可获得较大的藻密度和油脂含量,混养培养还能影响藻细胞内的油脂代谢路径,当混养培养至衰亡期时小球藻细胞内油脂含量最高,藻油主要以甘三酯形式存在;甘油的添加对小球藻培养几乎没有起到促进作用。分别在槽式反应器、直管式反应器、鼓泡式反应器和气升式反应器培养小球藻,结果表明:气升式反应器中培养的小球藻密度约是槽式反应器中的1.5倍,是鼓泡反应器中的1.2倍;对小球藻生长动力学模型简化处理,并与实验数据拟合,得出:添加有机碳源时,小球藻比生长速率高,添加葡萄糖的比生长速率较添加甘油高,供氮培养稳定期一次性加入葡萄糖时,小球藻比生长速率最大,为0.62,藻细胞倍增时间1.12d。
(2)利用化学絮凝法采收纤维藻,分别以三氯化铁、硫酸亚铁、明矾、硫酸铝、硫酸锌、氢氧化钙、聚丙烯酰胺、壳聚糖等为絮凝剂,通过对比分析,三氯化铁在纤维藻采收中絮凝效果较好,0.6g/L絮凝剂添加量,絮凝时间为15min,藻细胞采收率接近100%,且采收后残液可循环利用。
(3)沼液中富含N、P等元素,直接排放会造成水体的富营养化,微绿球藻能吸收沼液中的富营养元素,减少水体污染。微绿球藻能在添加3%海水晶的沼液中良好的生长,无需再添加其他营养成分;培养过程中适时补水以维持培养过程中盐度、电导率等的稳定,提供一个稳定的培养环境;在沼液浓度为20%时,微绿球藻生长最优,最大细胞数达2.645×10~7cells/ml;培养结束后,液体中N、P含量分别降至8.93mg/L、3.13mg/L,脱除率分别为88.8%、72.0%。利用沼液培养微绿球藻不但降低了培养成本还有效地防治了环境污染。
【关键词】:
【学位授予单位】:浙江工业大学【学位级别】:硕士【学位授予年份】:2012【分类号】:TE667【目录】:
摘要4-6ABSTRACT6-9目录9-12第一章 文献综述12-27 1.1 引言12-13 1.2 微藻生物柴油的工艺13-25
1.2.1 藻种筛选13-15
1.2.2 微藻培养15-21
1.2.3 藻细胞的采收21-24
1.2.4 藻细胞破壁提油24
1.2.5 生物柴油的制备及后处理24-25 1.3 利用废弃物培养微藻的研究25-26 1.4 本章小结26-27第二章 微藻的培养27-54 2.1 引言27 2.2 实验材料和仪器27-28 2.3 试验方法28-34
2.3.1 培养液的配置28-29
2.3.2 微藻生长的表征29-30
2.3.3 藻种的选择30
2.3.4 微藻干重、细胞密度、OD680 值三者之角关系30-31
2.3.5 藻种的扩繁31-32
2.3.6 微藻采收提油32
2.3.7 藻油的 TLC 分析32
2.3.8 藻油酸值的测定32
2.3.9 生物柴油成分分析32-33
2.3.10 光生物反应器33-34 2.4 结果与讨论34-48
2.4.1 营养成分对微藻生长的影响34-40
2.4.2 培养系统对微藻生长的影响40-42
2.4.3 纤维藻的半连续培养及碳源对其影响42-43
2.4.4 营养元素对油脂积累的影响43-48 2.5 小球藻生长动力学48-52
2.5.1 供氮自养小球藻动力学分析48-49
2.5.2 其他培养条件下小球藻生长动力学分析49-52
2.5.3 小球藻油脂生成动力学52 2.6 本章小结52-54第三章 纤维藻的絮凝采收54-66 3.1 引言54 3.2 主要试剂及仪器54 3.3 实验方法54-55
3.3.1 实验条件及操作方法54
3.3.2 纤维藻采收及采收率的计算54
3.3.3 絮凝剂的作用机理54-55 3.4 结果与讨论55-65
3.4.1 铁系絮凝剂55-59
3.4.2 铝系絮凝剂59-63
3.4.3 其他絮凝剂63-64
3.4.4 最佳絮凝剂的选择64-65 3.5 本章小结65-66第四章 沼液培养微绿球藻66-84 4.1 引言66 4.2 实验方法66-69
4.2.1 试剂和仪器66-67
4.2.2 实验方法67-69 4.3 沼液原始成分的分析69-71
4.3.1 灭菌前后沼液中总氮含量69
4.3.2 灭菌前后沼液中总磷含量69-70
4.3.3 沼液中 COD 的测定70
4.3.4 沼液有机成分分析70-71
4.3.5 沼液在灭菌和调 pH 前后的变化71 4.4 结果与讨论71-82
4.4.1 沼液与 F/2 培养微绿球藻的对照71-72
4.4.2 灭菌前后培养微绿球藻对照72-73
4.4.3 沼液 pH 对微绿球藻生长的影响73-74
4.4.4 微藻培养过程中水蒸发的影响74-76
4.4.5 微量元素和沼液浓度的影响76-78
4.4.6 培养过程中主要参数的变化78-82 4.5 本章小结82-84第五章 结论与展望84-87 5.1 结论84-85 5.2 展望85-87参考文献87-93致谢93-94攻读硕士学位期间发表的论文94
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